Ghrelin对高糖诱导的海马神经细胞tau蛋白磷酸化和糖代谢的影响及机制研究

【摘要】： Ghrelin是28个氨基酸残基构成的小分子多肽,主要由胃底粘膜的X／A样细胞分泌。它可与生长素促泌物受体(growth hormone secretagogue receptor 1a, GHSR-1a)结合促进生长素(growth hormone, GH)分泌。体内循环的ghrelin有两种形式：一种是无活性的(unacylated ghrelin, UAG), N端去辛酰基化；另一种是有活性的(acylated ghrelin, AG), N端辛酰基化,该结构是维持ghrelin的生物学活性所必需的。GHSR-1a在外周组织和中枢神经系统均有表达,ghrelin与其结合后在中枢神经系统的神经内分泌调节中起到重要作用,如对饮食和食物摄取的调节,能量和葡萄糖内环境稳定的调节,学习和记忆能力的调节。有研究证实,ghrelin是海马学习记忆过程中重要的调节因子。 糖尿病(diabetes mellitus, DM)是由多种病因引起的胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶细胞对胰岛素敏感性降低,继而引起糖、蛋白质、脂肪和水、电解质代谢异常的一种综合症,以慢性高血糖为主要特征。高血糖在2型糖尿病(T2DM)中不仅是次于胰岛素抵抗的重要体征,也是引起靶器官胰岛素抵抗的主要原因。作为一种系统性疾病,糖尿病可以引起多种组织、器官的结构和功能的改变,其中继发于糖尿病的视网膜、肾病及周围神经等病变已经得到人们广泛认识和关注。有研究表明高血糖是神经系统损伤的重要原因,糖尿病患者中痴呆的危险性明显增加,往往伴有认知功能障碍,如学习和记忆等脑功能损害。 流行病学研究显示伴有胰岛素抵抗的糖尿病患者有30-65%可发展为阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)。最近也有研究发现大脑的胰岛素缺乏和脑内的胰岛素抵抗状态和AD发病有关,有学者提出AD可能是“3型糖尿病”。因此,认为胰岛素抵抗导致代谢紊乱和认知障碍是糖尿病和AD共同的病理机制。Ghrelin可以改善AD模型大鼠的认知动作。有研究显示ghrelin可以调节胰岛素的敏感性,并提出可能是一种潜在的新的治疗糖尿病和AD导致的脑功能异常的药物。但是潜在的机制目前国内外很少有人报道。 葡萄糖是哺乳动物脑内主要的能量来源,对维持正常的大脑功能有重要作用。目前发现葡萄糖转运蛋白(GLUTs)家族有14种亚型。在脑内,葡萄糖转运体1(GLUT1)主要在血脑屏障和胶质细胞中表达,葡萄糖转运体3 (GLUT3)负责神经细胞的葡萄糖转运且不依赖胰岛素。但是,这些葡萄糖转运体不能负责海马区的整个葡萄糖代谢,而且,GLUT3位于神经细胞的突起而不在细胞体,因此有位于细胞体的其它葡萄糖转运蛋白负责神经细胞的葡萄糖摄取和利用。在胰岛素敏感的外周组织,细胞通过GLUT4易位不断的摄取葡萄糖,同样这个过程也发生在大脑的某些区域,包括海马神经细胞。 神经纤维原缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)是AD在组织病理学重要标志之一。NFTs由高度磷酸化的tau蛋白组成,其数量和认知障碍相关。在tau蛋白磷酸化的过程中,GSK-3p起到重要作用。磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶B(Phosphoinositide 3-kinase/Protein kinaseB, PI3-Kinase/AKT)是胰岛素信号转导的经典途径。胰岛素信号系统受损导致PI3-K/Akt信号通路障碍,引起GSK-3p活性增加,导致tau蛋白高度磷酸化。AS160是Akt底物,一种与Rab蛋白具有特异性作用的GTP酶激活蛋白(GAP),对GLUT4的易位有重要作用,最新的研究表明AS160是胰岛素信号中最接近GLUT4易位的信号分子。Grillol发现神经细胞中胰岛素利用同外周组织一样的信号转导系统刺激葡萄糖转运体4(GLUT4)向细胞膜易位摄取葡萄糖。 Ghrelin能调节胰岛素敏感性,刺激胰岛素诱导的葡糖糖摄取增加,有调节记忆的作用。因此,我们以原代培养的大鼠海马神经细胞为研究对象,探讨ghrelin对高糖诱导的神经细胞tau蛋白磷酸化和葡萄糖代谢的影响。进一步探讨其潜在的作用机制,包括PI3-K/Akt-GSK-3p、AS160及GLUT4表达的变化。进而深入了解ghrelin的功能,为DM是AD的危险因素提供进一步的理论依据,为临床改善糖尿病及AD引起的认知功能障碍提供的新的可能的治疗方向。 材料与方法 一、实验材料 1、原代乳鼠海马神经细胞培养相关试剂 2、MTT相关试剂 3、神经细胞葡萄糖消耗实验相关试剂 4、神经细胞葡萄糖摄取实验相关试剂 5、免疫细胞化学染色相关试剂 6、半定量RT-PCR检测基因的相关试剂 7、Western blotting印迹杂交相关试剂 二、实验方法 1、乳鼠海马神经细胞的提取、培养及鉴定 (1)乳鼠海马神经细胞的提取 取新生(出生24h以内)的SD大鼠,冰浴麻醉约10min,用75%乙醇消毒。断头后放在冰袋上的90mm培养皿中。去除颅骨,取出双侧的海马放入盛有预冷的D-Hanks液的培养皿中,逐一分离海马组织上的软脑膜和毛细血管网。当所有的海马组织分离后,清洗2次,放入培养皿中。将组织剪成1mm3的小块,移入50ml离心管中,加入与组织等体积的0.25%胰蛋白酶(含EDTA)。在37℃,5%CO2条件下消化30min左右,用含有血清的培养液终止反应,用lml移液器吹打混匀组织液。1200rmp,离心10min,弃上清,加入10ml含10%胎牛血清、10%马血清的DMEM培养基,用移液器轻微混悬细胞。用孔径为200目的尼龙网过滤后,血细胞计数板计数细胞。用种植液稀释细胞悬液,以1.5×105、5×105或2.5×106／孔的密度分别接种于事先用多聚赖氨酸浸泡过的96孔培养孔板、24孔培养孔板或6孔培养孔板内,将培养板移入湿润的培养箱,在37℃和5%CO2条件下培养细胞。 (2)乳鼠海马神经细胞的原代培养 将提取到的神经细胞用DMEM培养基(含10%胎牛血清、10%马血清、1%谷氨酰胺和100U／ml青霉素、100μg／ml链霉素)在37℃,5%CO2的条件下湿润的培养箱中培养,于接种24h后全量换液,换成Neurobasal Medium/B27无血清培养基,以后每2天换液1／3—1／2,待7天后,细胞生长成熟可以用于实验。NeurobasalMedium培养液的葡萄糖浓度是25mM,高于其3倍的浓度可以视为高糖(75mM)环境。 (3)乳鼠海马神经细胞免疫细胞化学染色鉴定 用神经元烯醇化酶(NSE)抗体作为神经细胞的识别标志。当细胞生长成熟后,用PBS清洗一次；4%的多聚甲醛溶液在室温固定20min; 3%H2O2阻断内源性过氧化物酶10min；加入非免疫性动物血清封闭液(正常山羊血清),20℃下孵育15min；加入一抗兔抗鼠NSE多克隆抗体(1：250稀释),4℃水盒孵育过夜；滴加二抗(生物素标记的山羊抗兔IgG)20℃下15min,辣根过氧化酶(HRP)标记的链霉菌抗生物素蛋白孵育15min,新鲜配制的DAB显色,苏木精复染,倒置相差显微镜照相记录染色情况。 2、MTT法检测细胞活性和数量 将5mg/ml的MTT原液与无血清的DMEM培养液按体积1：9配成MTT培养液,待孔内原有培养液移出后,每孔加入MTT培养液50μl,37℃继续培养,4h后终止培养,并小心吸弃孔内培养上清夜,每孔加入200μl二甲基亚砜(DMSO),微型震荡器震荡10min使结晶物充分溶解。选择490nm波长,在酶标仪上测定各孔的吸光度值(OD值),以光密度值反映细胞活性和数量的多少。 3、神经细胞葡萄糖消耗实验 神经细胞的葡萄糖消耗量通过葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(GOD-POD)法来检测。细胞以1.5×105个／孔接种在96孔板中。在培养第7天,原始的培养基换成不同的处理因素。按各实验组细胞经分组处理后用于实验。将各样本浓度稀释5倍,取2μl放入200μl的检测液中,在室温反应30min达到平衡并保持稳定,在490nm酶标仪中测定各管吸光度值(OD值),根据公式计算葡萄糖浓度,再乘以稀释倍数,与未接种细胞的空白孔的含量糖均值相减,计算葡萄糖的消耗量。 4、[3H]-2-deoxy-D-glucose ([3H]-DG)示踪法检测神经细胞葡萄糖摄取的变化 海马神经细胞培养成熟后按各实验组处理后用于实验。Lock's Buffor缓冲液洗涤细胞3次,用400μl缓冲液37℃孵育细胞30min。弃去缓冲液,各组加或不加胰岛素共同继续孵育30min。加入[3H]-DG至终浓度0.2μCi/ml 30min。用预冷的PBS终止反应,冲洗3次,将细胞裂解于O.1N NaOH中,反复吹打后,在37℃中裂解2h,吹打混匀细胞,将各样本液体滴在微孔滤纸上,经真空滤泵后,室温晾干。将微孔滤膜浸入12ml液闪液中,液体闪烁计数法测定检测各组的每分钟总衰变数(CPM)。测定细胞蛋白浓度。计算葡萄糖摄取量。每组重复5次。 5、RT-PCR法检测GLUT3、4, PPARymRNA的表达 用于实验的细胞按分组分别干预后,弃去培养液,在无菌条件下用D-Hanks液轻微冲洗2次,加入预冷的1ml TRIzol,反复吹打,充分裂解细胞后移入新的经DEPC水处理过的无菌Eppendoff (Ep)管中,采用一步法提取总RNA。RNA纯度及浓度的测定；逆转录合成cDNA;引物序列及反应条件；3%琼脂糖凝胶电泳；紫外透射仪观察,应用凝胶图像处理系统扫描各条带的光密度,以GAPDH产物的光密度值作为内参,计算不同条件下各基因扩增量的比值,进行半定量分析。 6、免疫细胞化学染色检测ptau[Ser199]、GLUT4的表达 细胞接种在盖玻片上,培养7d后,用4%的多聚甲醛溶液在室温固定20min；每张盖玻片加3%H202阻断内源性过氧化物酶10min, PBS洗涤3次,每次5min；加入非免疫性动物血清封闭液(正常山羊血清),20℃下孵育15min；加入一抗为兔抗鼠的ptau[Ser199](1:500稀释)、GLUT4 (1:250稀释)多克隆抗体,4℃水盒孵育过夜；滴加二抗(生物素标记的山羊抗兔IgG)20℃下15min,辣根过氧化酶(HRP)标记的链霉菌抗生物素蛋白孵育15min,新鲜配制的DAB显色,自来水冲洗5min,60℃烘干后中性树脂封片。倒置相差显微镜照相记录染色情况。 7、Western blotting检测pAkt[Ser473]、ptau[Serl99]、pGSK-3p[Ser9]和AS160磷酸化 实验细胞用预冷PBS缓冲液洗2遍,细胞刮收集细胞,根据蛋白提取试剂盒操作分别提取各组细胞总蛋白,采用Bradford法测定蛋白浓度,每组蛋白质样本20μg在95℃下变性5min,进行SDS—PAGE电泳,转膜后3%BSA封闭2h,用TBST洗膜后分别加5%BSA/TBS稀释的多克隆抗体,4℃孵育过夜,再次用TBST洗膜后,加入辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下杂交2h,洗膜后ECL超敏发光液进行显色,每组重复3次,结果用Image Analysis Softwave V7.0分析软件对目的条带进行灰度值分析。 8、统计学分析 所有数据用SPSS 13.0软件处理,结果用均数±标准差(x±SD)表示,每组实验重复3次或3次以上。采用单因素方差分析(ANOVA)检验,post-hoc分析,t检验进行均数间的多重比较,以p0.05为统计学有显著差异。 结果 1、高糖环境对神经细胞的糖代谢有抑制作用；ghrelin可以增加神经细胞的葡萄糖代谢。经过不同浓度的ghrelin (1-100nM)干预,神经细胞在1nM作用下糖代谢有所增加但是没有明显变化,在10nM和100nM作用下糖代谢明显增加,呈剂量依赖性,经100nM胰岛素诱导后增加更明显。 2、免疫细胞化学法检测tau蛋白磷酸化。高糖环境下,tau蛋白磷酸化增加,表现为胞浆染色和正常糖环境相比明显加深,经过ghrelin干预后,胞浆染色变浅,tau蛋白磷酸化减少。 3、Western blotting检测tau蛋白磷酸化的变化。高糖组tau蛋白磷酸化增加,ghrelin可以减弱tau蛋白磷酸化。总蛋白无明显变化。 4、RT-PCR检测GLUT3、GLUT4和PPARy的基因表达。在原代培养的海马神经细胞中除GLUT3表达外,也有GLUT4的表达,但是后者比前者的表达量要少。在高糖环境下,ghrelin和胰岛素干预前后神经细胞中GLUT4和PPARy的基因表达没有发生变化。说明在短时间内ghrelin可能并不是通过PPARy变化增加胰岛素敏感性的；对葡萄糖摄取的改善不是通过GLUT4量的改变实现的,可能和GLUT4易位有关。 5、Western blotting法检测Akt、AS160及GSK-3β磷酸化的变化。Ghrelin可以增加不同葡萄糖浓度的神经细胞Akt、AS 160及GSK-3β磷酸化水平。在高糖组Akt. AS 160和GSK-3β磷酸化水平较正常组降低明显。经过ghrelin干预后,Akt、AS 160和GSK-3β磷酸化增加明显,总蛋白变化不明显。 6、免疫细胞化学法检测GUT4易位的变化。GLUT4在正常对照组的胞浆和胞膜均有表达,为棕色至棕褐色,经高糖作用24h后,易位受到抑制,经ghrelin干预后,易位增加,经胰岛素诱导后这种作用增加更明显。 7、加入PI3-K特异性抑制剂wortmannin(50nM)和ghrelin共同作用,可以削弱ghrelin改善tau蛋白磷酸化和增加葡萄糖摄取的作用。 结论 1、高糖环境能使海马神经细胞tau蛋白磷酸化增加,糖代谢降低,可能存在胰岛素抵抗。 2、Ghrelin能增加高糖诱导的神经细胞的糖代谢,改善胰岛素抵抗。而加入胰岛素后,这种作用更明显。Ghrelin和胰岛素促进神经细胞糖代谢是协同作用。 3、Ghrelin可以降低高糖导致的tau蛋白异常磷酸化。 4、Ghrelin对海马神经细胞的葡萄糖摄取的调节最终可能是通过GLUT4易位实现的。 5、Ghrelin增加高糖诱导的神经细胞的Akt、AS 160和GSK-3p磷酸化水平,这种作用在正常糖浓度下更明显。Ghrelin至少是通过P13-K/Akt-GSK-3β途径改善tau蛋白异常磷酸化和胰岛素抵抗。