硒干预治疗对碘诱发NOD.H-2~(h4)甲状腺炎小鼠CD4~+CD25~+调节性T细胞影响的实验研究

【摘要】： 目的 碘摄入量与甲状腺疾病之间的关系近年来一直受到内分泌学界的关注。碘缺乏可以导致碘缺乏病(Iodine deficiency disorders, IDD),而碘过量同样可以影响甲状腺疾病的发生。硒元素(Selenium, Se)是人体必须的微量元素之一,如同元素碘一样,也参与了甲状腺激素的合成、活化和代谢过程。另外,硒对免疫系统也有重要的影响,硒缺乏可能会对包括细胞免疫和体液免疫在内的机体免疫功能都会造成不利的影响。最近的一些临床研究发现,硒补充治疗可以降低自身免疫性甲状腺炎(Autoimmune thyroiditis, AIT)患者血清甲状腺特异性自身抗体的滴度,提示硒干预对于AIT患者来说可能是一种有效的治疗措施,但是具体的作用机制尚未阐明。调节性T细胞(Regulatory T cell, Treg)主要在机体免疫系统中发挥负向调节作用,既能抑制不恰当的免疫反应,又能限定免疫应答的范围、程度及作用时间,抑制效应细胞的增殖及免疫活性。近年来,CD4+CD25+调节性T细胞在多种自身免疫性疾病中的作用日益引起人们的关注,动物实验和临床研究发现CD4+CD25+调节性T细胞数目和功能的异常与多种自身免疫性疾病关系密切。本研究通过高碘诱发NOD.H-2h4小鼠发生自发性自身免疫性甲状腺炎(Spontaneous autoimmune thyroiditis, SAT),观察此动物模型中CD4+CD25+调节性T细胞的动态变化,并对其进行硒补充治疗,观察硒干预对CD4+CD25+调节性T细胞的影响,探讨碘致AIT以及硒干预治疗AIT的免疫机制。 方法 选择4周龄NOD.H-2h4小鼠,随机分为对照组、高碘饮水组,每组10只动物。对照组喂以无菌双蒸水；高碘组饲以含0.005%碘化钠(碘化钠浓度为50mg/L)的无菌水,分别于实验开始后第4、8、12、16周麻醉处死各组动物。留取各组NOD.H-2h4小鼠甲状腺,HE染色观察淋巴细胞浸润情况并进行甲状腺炎症程度评分；酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组小鼠血清甲状腺球蛋白抗体(TgAb)水平；制备各组NOD.H-2h4小鼠脾脏单个核细胞悬液,流式细胞仪分析CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例的变化；提取小鼠脾细胞总RNA,实时定量RT-PCR检测CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞特异性转录因子Foxp3 mRNA表达水平。在以上实验的基础上,另外选择4周龄NOD.H-2h4小鼠,随机分为对照组、SAT非硒治疗组以及SAT硒治疗组,每组15只动物。对照组喂以无菌双蒸水；SAT非硒治疗组小鼠饲以含0.005%碘化钠(碘化钠浓度为50mg/L)的无菌水8周诱导发生SAT；造模成功后SAT硒治疗组小鼠给予含0.3 mg/L亚硒酸钠的无菌双蒸水,在给药8周时麻醉处死各组动物。同样留取各组NOD.H-2h4小鼠甲状腺、血清、脾脏等进行上述指标的检测,并采用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)检测小鼠血清硒水平。应用SPSS 16.0软件处理和分析数据。 结果 NOD.H-2h4小鼠高碘饮水8周后甲状腺炎的发生率明显高于对照组,甲状腺组织有不同程度的淋巴细胞浸润,甲状腺相对重量及血清TgAb水平均较对照组小鼠明显升高(P0.05)。发生SAT的NOD.H-2h4小鼠脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞所占比例和Foxp3 mRNA表达量均较对照组明显降低(P0.05),并且在甲状腺炎的发生发展过程中始终保持较低的水平。随着高碘饮水时间的延长,甲状腺炎的发生率、甲状腺炎症程度、甲状腺相对重量及血清TgAb滴度均逐渐升高,而脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞所占比例则逐渐降低。SAT硒治疗组NOD.H-2h4小鼠血清硒水平较SAT非硒治疗组和对照组均明显升高(P0.05)。与SAT非硒治疗组相比,硒治疗组NOD.H-2h4小鼠CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比例和Foxp3 mRNA表达量均明显升高(P0.05)。同时,SAT硒治疗组NOD.H-2h4小鼠血清TgAb滴度以及甲状腺内淋巴细胞浸润程度均较同周龄SAT非硒治疗组小鼠明显降低(P0.05)。 结论 1、高碘诱导的NOD.H-2M甲状腺炎小鼠的脾脏CD4+CD25+调节性T细胞比例明显降低,提示CD4+CD25+调节性T细胞可能参与该小鼠自身免疫性甲状腺炎的发生发展。 2、高碘诱导的NOD.H-2h4甲状腺炎小鼠给予硒补充治疗后,甲状腺炎症程度及血清甲状腺特异性抗体滴度均明显降低,同时,脾细胞中CD4+CD25+调节性T细胞比例及其转录因子Foxp3 mRNA表达水平均明显升高。提示硒干预可能通过影响NOD.H-2h4小鼠外周CD4+CD25+调节性T细胞的水平发挥治疗AIT的作用。 目的 由于甲状腺激素可直接促进大脑的发育和成熟,因此甲状腺激素对胎儿的生长发育至关重要。胎儿的甲状腺激素有两个来源,即母体供给和由胎儿自身甲状腺产生。然而,胎儿的甲状腺功能在妊娠前三个月尚未完全建立,其甲状腺激素主要来自于母亲。目前认为母亲甲状腺功能减退症(甲减)与其后代智力发育异常有关,但是关于妊娠期轻度的甲状腺功能缺陷对其后代是否具有相同的影响仍然存在争论。本项前瞻性研究旨在探讨妊娠早期母亲亚临床甲状腺功能减退症(亚临床甲减)对其后代智力和运动发育的影响。 方法 选择来自辽宁省沈阳市10家医院妇产科门诊进行常规产前检查并同意参加中国医科大学内分泌研究所流行病学调查的1761名妊娠早期妇女作为研究对象,所有入选对象均填写问卷调查表,留取了空腹晨尿和非抗凝静脉血并分离血清,采用固相化学发光酶免疫分析法(ICMA)测定血清促甲状腺激素(TSH)、游离甲状腺素(FT4)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb),采用砷铈催化分光光度法测定尿碘水平。研究对象的入选标准为：1)妊娠8周以内；2)无碘缺乏地区的居住史；3)无甲状腺疾病的个人史和家族史；4)无其他自身免疫性疾病的个人史。以美国内分泌学会等2007年颁布的《妊娠和产后甲状腺功能异常处理的临床指南》建议的TSH≥2.5 mIU／L为切点筛查到亚临床甲减(SCH)孕妇38例(血清FT4正常、TPOAb滴度 50 IU/mL),采用妊娠特异性甲状腺功能参考范围将其进一步分为两个亚组：SCH-A组(2.5≤TSH 3.93 mIU/L),18例；SCH-B组(TSH≥3.93mIU/L),20例。同时选择同一研究队列中30例甲状腺功能正常、TPOAb阴性的妊娠妇女作为对照组。对研究对象的后代在20～30月龄时应用贝利婴幼儿发育测量表(BSID)进行智力发育指数(MDI)和运动发育指数(PDI)测评。应用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析。 结果 妊娠早期母亲SCH组孕妇后代MDI评分平均比对照组低6.55分(P=0.001)；PDI评分比对照组平均低6.31分(P=0.003)。SCH-A和SCH-B组后代MDI评分均值比对照组分别低3.39和9.40分(P=0.125,P0.001)；PDI评分均值比对照组分别低4.35和8.07分(P=0.070,P=0.001)。另外,SCH、SCH-A和SCH-B组后代MDI评分低于110分所占的百分比分别为：39.5%、16.7%和60%,与对照组(16.7%)相比,其中SCH和SCH-B组有统计学差异(P=0.04,P=0.002)。SCH、SCH-A和SCH-B组后代PDI评分低于110分所占的百分比分别为：44.7%、27.8%和60%,与对照组(20%)相比,其中SCH和SCH-B组有统计学差异(P=0.032.P=0.004)。Spearman秩相关分析显示,后代智力发育指数和运动发育指数评分均与母亲妊娠早期血清TSH水平呈明显负相关(r=-0.425,P0.001；r=-0.394,P=0.001)。单因素方差分析(ANOVA)多组间比较结果显示,母亲妊娠早期不同水平TSH对其后代智力和运动发育指数评分的影响均存在有统计学差异(F=9.277,P0.001；F=5.909,P=0.004)。有序logistic回归分析显示,妊娠早期母亲血清TSH水平高于T1期妊娠特异性参考范围上限(≥3.93 mlU/L)导致后代智力发育指数和运动发育指数评分降低的风险分别是对照组的8.66、6.27倍(OR=8.66,95% CI 2.72～27.57；OR=6.27,95% CI 2.03～19.34)。 结论 1、妊娠早期母亲单纯的高TSH血症(FT4处于妊娠早期特异性参考范围以内,TPOAb阴性)与其后代智力发育指数和运动发育指数呈负相关关系。 2、采用妊娠早期特异性的正常参考范围诊断的妊娠早期母亲亚临床甲减(TSH≥3.93mIU/L, FT4处于妊娠早期特异性参考范围以内,TPOAb阴性)是其20～30月龄后代智力和运动发育评分减低的独立危险因素。