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《辽宁医学院》 2011年
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肌源性干细胞在修复大鼠脊髓损伤过程中Notch1基因的表达差异

张赫  
【摘要】:目的 探讨肌源性干细胞(Muscle derived stem cells,MDSCs)在修复大鼠脊髓损伤过程中Notch1基因的表达差异。 方法 1、采用机械-混合酶消化法分离培养大鼠MDSCs,结蛋白(Desmin)细胞免疫化学鉴定其为肌源性干细胞。NFG诱导MDSCs并采用免疫组织化学法检测诱导后的细胞表达NSE特异性标志物。 2、根据实验要求,选取120只大鼠样本,动物按随机数目表法分为:A组:NGF诱导后且BrdU标记的MDSCs组(n=30);B组:未诱导且BrdU标记的MDSCs组(n=30);C组:对照组(n=30)及D组:空白对照组(n=30)。A、B、C组按取材时间不同分为1周、4周、8周。 3、手术方法:制作脊髓半横断模型。脊髓损伤后使用微量注射器分别向A组注射进行NGF诱导分化后且BrdU标记的MDSCs培养液,向B组注射等量未经诱导分化但经BrdU标记的MDSCs培养液,C组注入相同剂量的PBS液。 4、各组大鼠在存活期间按不同时间点测定各组大鼠后肢运动功能(BBB运动功能评分及斜板实验)。 5、免疫组化染色检测观察MDSCs在大鼠体内的存活、迁移及分化情况。 6、RT-PCR和Western技术检测肌源性干细胞植入后Notch通路中关键基因的表达情况。 结果 1、经过机械-混合酶消化和差速贴壁后,成功培养出高纯度、高活性的MDSCs,细胞免疫化学结果为Desmin(+)(阳性率80%)。 2、诱导过程中,细胞生长状态良好,形态呈渐进性变化,未见神经球形成;诱导组7d后神经样细胞的胞体和突起NSE染色呈强阳性(37.29±1.59)%,而未诱导组的细胞阳性细胞率极低(4.26±0.34)%,两组之间差异明显(P0.01);诱导组的MDSCs样品中检测到NSE表达水平高于未诱导组(P0.01)。 3、行为观察结果:伤后1周时A组(诱导组)的评分略高于B组(未诱导组)但均高于C组(对照组),随着时间的延长,各组差异逐渐明显,A组的评分明显高于B组、明显优于未加干预的C组。结果显示,经NGF诱导肌源性干细胞移植治疗脊髓损伤的疗效明显优于单独应用肌源性干细胞移植的方法。 4、组织学结果:观察BrdU标记后移植的MDSCs在大鼠体内的存活、迁移及分化情况。A组损伤修复尤其明显,细胞数量多于B组。结果显示,经NGF诱导后的MDSCs在大鼠体内修复脊髓损伤效果优于单独应用的MDSCs。 5、RT-PCR及Western检测结果显示:在大鼠脊髓损伤过程中Notch信号通路中的Notch1节点基因mRNA及Notch1蛋白均呈现低表达,诱导组和未诱导组有显著差异(P0.05)。 结论 1、本实验采用机械-混合酶消化法进行体外培养MDSCs的方法原代培养获得了高纯度、高活性的MDSCs,Desmin细胞免疫化学方法鉴定证明。 2、本实验采用NGF对MDSCs进行体外诱导分化成神经样细胞植入大鼠脊髓损伤处进行治疗,取得一定效果,这对MDSCs做为种子细胞修复脊髓损伤有重要意义。 3、在大鼠脊髓损伤过程中Notch信号通路中的Notch1mRNA及Notch1蛋白均呈现低表达,Notch信号分子低表达可促进MDSCs分化为神经样细胞。
【学位授予单位】:辽宁医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R329

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