收藏本站
《大连医科大学》 2011年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

结核分枝杆菌Rv3717基因的克隆、表达及功能鉴定

陈燕  
【摘要】:结核分枝杆菌是全球主要的病原体之一,随着多重耐药菌株的增加,其威胁性也随之增大。结核分枝杆菌的细胞壁相对较厚、硬并且具有疏水性,能够有效地保护细菌,因此抗菌药物的开发具有较高的难度。 乙胺丁醇(Ethambutol,EMB),是一种一线抗结核的药物。本课题利用生物信息学的方法,发现一种未知功能的基因Rv3717。当乙胺丁醇作用于结核分枝杆菌后,Rv3717基因的表达上调。该基因被预测具有水解肽聚糖的功能,可能会造成肽聚糖的水解,引起细胞的自溶。 肽聚糖是结核分枝杆菌细胞壁核心结构的重要组成部分,目前关于分枝杆菌细胞壁自溶素(也称为肽聚糖水解酶)的了解并不多。已知枯草芽孢杆菌的cwlB基因是一种已知的细胞壁自溶素,把此基因的序列与结核分枝杆菌的基因组序列进行BLAST比对,找到两种同源基因Rv3915和Rv3717,推测该两种基因表达的蛋白质可能同样具有肽聚糖水解酶的活性。有研究表明,Rv3915基因被成功克隆表达并且经鉴定具有肽聚糖水解酶的活性。因此,Rv3717基因是否也有此活性是本课题所要解决的问题。 对Rv3717基因肽聚糖水解酶活性的确定,有利于揭示EMB抗结核的作用机制,并为发现新的药物靶点进而开发新一代抗结核药物提供理论依据。 目的:通过对Rv3717目的基因的克隆表达,纯化目的蛋白,以对Rv3717基因的功能进行鉴定。 方法:以结核分枝杆菌基因组DNA为模板,利用PCR技术进行目的基因的扩增。使用克隆载体pMD18-T与目的基因以“A-T”连接方式构建克隆质粒pMD18-Rv3717;被扩增的目的片段经测序正确后,载体和目的片段分别经双酶切后进行连接,构建表达质粒。利用不同的载体和不同的宿主菌,通过调节诱导剂的浓度和诱导温度等进行目的蛋白的优化表达。利用SDS-PAGE和Western blotting检测目的基因的表达,利用Ni~(2+)亲和层析柱对目的蛋白进行纯化并用酶谱法对目的蛋白进行功能的检测。 结果:构建了克隆质粒pMD18-Rv3717;扩增的目的基因经测序正确后,构建了无突变碱基的表达质粒pET29b-Rv3717和pET16b-Rv3717。表达质粒pET29b-Rv3717在所使用的各种宿主菌中的蛋白表达量极低。表达质粒pET16b-Rv3717在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达量高,但是绝大部分是以包涵体的形式存在,上清液中的可溶性目的蛋白比较少。目的蛋白的上清液经镍柱纯化以后,得到含有少量杂蛋白的目的蛋白的纯化物。纯化的目的蛋白没有检测到肽聚糖水解酶的活性。 结论:利用分子克隆技术克隆了结核分枝杆菌的基因Rv3717;使用表达质粒pET16b在大肠杆菌BL21(DE3)中过表达了目的基因,并且绝大部分目的蛋白是以包涵体的形式存在。本论文论述了目的基因Rv3717与肽聚糖水解酶的关系,未能检测出过表达的目的蛋白的肽聚糖水解酶的活性,但为进一步地探讨两者之间的关系提供了方法学的借鉴和物质基础。
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R378

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 柴俊;罗家琴;蒋成砚;朱文豪;张以芳;;牛结核分枝杆菌Ag85b基因的克隆及表达[J];云南大学学报(自然科学版);2007年S3期
2 王瑞博;井申荣;;结核分枝杆菌分泌蛋白TB10.4的功能和应用[J];生命的化学;2011年04期
3 牛雪;吴丛梅;高冷;赵韫慧;殷玉和;;结核分枝杆菌H_(37)Rv异柠檬酸裂解酶基因的克隆表达及活性[J];吉林大学学报(理学版);2011年04期
4 康健;王丽梅;王平;赵勇;张薇;韩文东;丁悦娜;孙志平;柏银兰;徐志凯;;小鼠结核分枝杆菌耐药模型的建立与评价[J];中国实验动物学报;2011年04期
5 王华南;亓英芳;朱婷;于申业;刘慧芳;司微;杨盛;王加明;冯拥军;李素兰;于秀婷;王春来;刘思国;;结核分枝杆菌pdhA基因的原核表达及其免疫原性分析[J];中国兽医科学;2011年07期
6 向志光;林树柱;董娜;袁伟;徐艳峰;秦川;;结核分枝杆菌感染小鼠的脾脏和肺脏组织荷菌量与病理变化[J];中国比较医学杂志;2011年08期
7 丁淑琴;王强;王淑静;王洁;张焱;;结核分枝杆菌rps12基因的克隆及核酸序列的分析[J];宁夏医科大学学报;2011年08期
8 胡锦;谢建平;;碱基切除修复与分枝杆菌基因组稳定性[J];中国细胞生物学学报;2011年03期
9 郭芳芳;邹立林;吴英松;胡志明;李金龙;吕建新;高基民;;用于时间分辨荧光免疫分析的结核分枝杆菌培养滤液蛋白10参照品的制备[J];南方医科大学学报;2011年06期
10 石华;戈朝晖;贾伟;马小明;牛宁奎;董辉;王自立;;结核分枝杆菌分泌蛋白MPB64表达纯化[J];宁夏医科大学学报;2011年08期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 温见翔;吴少庭;陈群;秦莉;袁仕善;雷明军;潘晖榕;林绮萍;张仁利;高世同;黄达娜;;结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化[A];全国新出现传染病学术研讨会资料汇编[C];2004年
2 刘焰;刘胜武;谈蓉;马立新;刘君炎;;结核分枝杆菌Ag85B与ESAT-6双顺反子重组腺表达载体的构建[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年
3 温见翔;吴少庭;陈群;秦莉;袁仕善;林绮萍;雷明军;潘晖榕;张仁利;高世同;黄达娜;;结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化[A];全国新出现传染病学术研讨会资料汇编[C];2004年
4 孙照刚;张健源;张旭霞;李妍;邱云青;田苗;聂理会;任卫聪;李传友;;变性高压液相色谱技术在结核分枝杆菌对链霉素的耐受性检测中的应用[A];2007年中国防痨协会全国学术会议论文集[C];2007年
5 陈曦;古淑香;贾红彦;李自慧;郑小静;刘忠泉;邢爱英;杜博平;张继增;张宗德;;结核分枝杆菌特异性分泌蛋白原核表达和纯化[A];中华医学会2008年全国结核病学术会议论文汇编[C];2008年
6 刘威龙;周伯平;张明霞;杨倩婷;朱秀云;王敏;邓群益;陈心春;;结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的高效表达及在结核菌特异性细胞免疫检测中的应用[A];中国防痨协会临床委员会、中国防痨协会基础委员会学术研讨会论文集[C];2008年
7 杨华;胡忠义;;变性高效液相色谱在结核分枝杆菌耐药性检测中的应用研究[A];2006中国防痨协会全国学会会议论文集[C];2006年
8 戴广明;曹以诚;杜正平;陈洵;黄曙海;逄宇;周杨;黄海荣;赵雁林;;结核分枝杆菌环介导恒温扩增(LAMP)快速检测方法的构建[A];中华医学会结核病学分会2010年学术年会论文汇编[C];2010年
9 许优;孙惠平;张增贤;刘莉娜;;关于结核分枝杆菌定量方法的研究[A];中华医学会结核病学分会2006年学术会议论文汇编[C];2006年
10 刘毅;李卫民;田苗;孙照刚;李传友;周辉;张治国;高铁杰;高峰;;快速筛选定义北京基因型结核分枝杆菌的新方法[A];2007年中国防痨协会全国学术会议论文集[C];2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 韩晓玲 通讯员 范敬群 金安江;华中农大研究成果获世界声誉[N];湖北日报;2009年
2 李燕燕 熊学莉;心脑血管病相关基因被发现[N];健康报;2006年
3 毛玉西;未来婴儿将有“基因说明书”[N];中国国门时报;2006年
4 张虎;高效菌株可以处理染料生产废水[N];中国纺织报;2005年
5 记者 耿挺;为T细胞“战士”打造“武器”[N];上海科技报;2008年
6 庄愉;新型抗结核疫苗的开发研究[N];中国医药报;2002年
7 实习生 周英;得不得心脏病 基因说了算?[N];科技日报;2011年
8 ;性别基因 让男性易患帕金森[N];健康报;2006年
9 丁香;基因工程让蘑菇成为制药厂[N];中国医药报;2007年
10 蔡民 刘丹 戴丽娟;钟南山称人流感如遇禽流感 可能变人传人禽流感[N];中国中医药报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 董海燕;中国13省市结核分枝杆菌基因多态性分析[D];中国疾病预防控制中心;2011年
2 陈嘉臻;结核分枝杆菌特异的RD2/RD11蛋白应用于结核免疫诊断的研究[D];复旦大学;2009年
3 王平;肺分枝杆菌感染临床特征、耐药模式、预后研究及肺组织结核分枝杆菌巢式PCR检测[D];北京协和医学院;2011年
4 陈军;武汉地区结核分枝杆菌药物敏感性及氟喹诺酮耐药分子机制的研究[D];华中科技大学;2011年
5 陈军;武汉地区结核分枝杆菌药物敏感性及氟喹诺酮耐药分子机制研究[D];华中科技大学;2011年
6 钟琪;结核分枝杆菌Rv0901基因功能研究[D];四川大学;2007年
7 乐军;耐药结核分枝杆菌的多维分析[D];复旦大学;2003年
8 孙勇;北京地区结核分枝杆菌耐药分子特点及结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物泵机制的初步研究[D];北京市结核病胸部肿瘤研究所;2012年
9 刘凯;结核分枝杆菌潜伏感染者和初发结核病患者免疫分子标识的筛选[D];北京协和医学院;2010年
10 段明;低温胁迫下番茄类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶基因的表达和功能研究[D];山东农业大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 臧大鹏;牛结核分支杆菌外膜蛋白OMP37、OMP12基因的克隆表达及免疫活性检测[D];山东农业大学;2008年
2 蔡溢;结核分枝杆菌RmlA的表达、纯化以及酶促反应动力学研究[D];大连医科大学;2006年
3 孙文霞;结核分枝杆菌抗原模拟肽纳米金生物传感器诊断结核病的研究[D];湖南师范大学;2011年
4 王霞芳;IFN-γ增强BALB/c小鼠对结核分枝杆菌感染的抵抗力[D];苏州大学;2002年
5 曹立雪;应用膜芯片检测结核分枝杆菌rpoB基因突变[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年
6 韩喜琴;噬菌体生物扩增法检测结核分枝杆菌药物敏感性研究及评价[D];北京市结核病胸部肿瘤研究所;2004年
7 王琳;结核分枝杆菌ClpX和ClpP2蛋白酶的克隆表达及其性质研究[D];西南大学;2010年
8 唐宇龙;检测结核分枝杆菌CFP10-ESAT6分泌蛋白的方法建立和应用研究[D];湖南农业大学;2007年
9 丁卫民;耐多药肺结核与结核分枝杆菌L型感染的临床研究[D];山西医科大学;2003年
10 吴玉敏;1.结核分枝杆菌去标签Mtb8.4-Hspx和Hspx-Mtb8.4基因克隆及表达 2.FTY720对肾移植受者治疗的安全性和有效性系统评价[D];兰州大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026