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五味子标准提取物对应激性肝损伤和肝癌转移的作用研究

唐淑红  
【摘要】:五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis (Turcz.) Baill的干燥成熟果实,为《中华人民共和国药典》收载法定药材,具有收敛固涩,益气生津,补肾宁心等功效,主要活性成份为木脂素类化合物。本实验以拘束应激负荷为实验模型,研究中药五味子的标准提取物——木脂素类化合物(Schisandra Lignans Extract, SLE)对小鼠应激性肝损伤和肝癌转移的影响,探讨五味子标准提取物的抗应激作用和可能机制。 首先,本研究以中药五味子的主要成分木脂素类化合物作为富集对象,通过对不同的提取分离工艺及总含量测定方法进行研究,以木脂素类化合物总含量为指标,确定最佳的提取分离工艺及总含量测定方法,并采用HPLC建立木脂素类化合物的指纹图谱。通过紫外分光光度法和变色酸法测定的总木脂素含量的对比,认为紫外分光光度法较变色酸法更准确、稳定,故选用紫外分光光度法作为总木脂素含量的测定。通过对不同的提取分离工艺及总含量测定方法进行研究,确定最佳的提取分离工艺为大孔吸附树脂的方法来富集总木脂素,其90%乙醇洗脱部分木脂素类的含量最高,总木脂素含量为51%。通过HPLC方法,初步建立SLE的指纹图谱,指认主要色谱峰为Schizandrin, Gominsin A, Gominsin C, Deoxyschizandrin,γ-Schizandrin, Schizandrin C。 七周龄雄性昆明种小鼠用于应激性肝损伤实验,采用拘束应激动物模型来评价SLE的抗应激作用。18 h拘束负荷后诱发小鼠应激性肝损伤,分别用赖氏法测定小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)和皮质酮(Corticosterone)活性,硫代巴比妥酸法测定肝组织丙二醛(MDA)水平,荧光酶标仪测定肝组织抗氧化能力指数(ORAC)水平,比色法测定肝组织自由基清除关键酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase, GPX)的活性,RT-PCR的方法测定肝脏SOD、GPX和糖皮质激素受体GR的mRNA表达的变化。拘束应激负荷18h后,正常对照组小鼠的ALT值为17.53±4.67IU/L,而应激模型组小鼠的ALT值为96.70±6.27 IU/L,拘束负荷小鼠血清ALT水平明显升高(P0.01),结果提示拘束应激可以造成严重的肝损伤。小鼠血浆Corticosterone水平显著升高,结果表明拘束应激负荷引起小鼠肝损伤与应激性激素水平的变化有关。给予五味子标准提取物可以明显降低拘束负荷诱发小鼠血清ALT活性升高,SLE低剂量组小鼠的ALT值为34.76±2.26IU/L,SLE高剂量组小鼠的ALT值为29.70±5.04IU/L,表明五味子标准提取物对应激性肝损伤有一定的保护作用。拘束应激组小鼠肝组织的脂质过氧化程度(MDA含量)明显升高,和抗氧化能力指数(ORAC值)明显降低,提示小鼠肝组织的抗氧化能力指数水平显著降低,肝脏处于脂质过氧化损伤的状态,这一现象表明应激性肝损伤可能与肝组织内的自由基增加及内源性抗氧化能力消耗有关。SLE高低剂量给药组均能不同程度地缓解肝脏的脂质过氧化程度,同时提高肝脏抗氧化能力指数,表明SLE对小鼠应激性肝损伤的保护作用可能与缓解肝脏的过氧化损伤有关。进一步机制研究结果显示,与正常对照组小鼠相比,应激模型组小鼠肝组织SOD水平、GPX水平显著降低。同时,RT-PCR实验结果显示,拘束应激组小鼠肝组织SOD1的mRNA、GPX的mRNA表达明显降低(P0.01),结果表明拘束负荷导致抗氧化能力降低。与拘束应激负荷组小鼠相比,SLE高剂量组小鼠肝组织的SOD1的mRNA、GPx mRNA表达明显增强(P0.05),实验研究表明SLE对缓解小鼠肝脏过氧化损伤的作用,可能与SLE中的活性成分能提高肝脏自由基清除关键酶SOD和GPX的活性,同时提高这两个酶的mRNA表达水平有关。因此,五味子标准提取物能降低拘束负荷小鼠血浆Corticosterone含量,降低肝组织过高的MDA,同时提高ORAC水平,提高自由基清除关键酶SOD和GPX的活性和mRNA表达水平,表明五味子标准提取物对应激性肝损伤的保护作用可能与缓解应激负荷造成肝脏细胞脂质过氧化损伤有关。 DAB/2小鼠拘束应激负荷20 h恢复后第3天,尾静脉注射P815肿瘤细胞株建立应激性癌转移动物模型,分别检测肝癌转移克隆数的变化和小鼠脾脏免疫器官指数,流式细胞术方法检测T淋巴细胞亚群和CTL杀伤活性的变化,并采用RT-PCR的方法测定肝脏Fas、Fas-L的mRNA表达的变化。实验结果显示,小鼠拘束应激负荷后,尾静脉注射P815肿瘤细胞株后12天,正常对照组小鼠肝脏癌转移克隆数为10.80±3.59个,而应激模型组小鼠肝脏癌转移克隆数增加到31.40±4.90个,表明拘束负荷诱发小鼠肝脏癌转移率明显升高(P0.01)。与应激模型组相比,SLE低高剂量组小鼠肝脏癌转移克隆数分别为26.40±4.81(P0.05)和18.40±3.72个(P0.01),表明SLE对应激诱发的P815细胞的肝癌转移有显著的抑制作用。免疫实验结果表明拘束应激使小鼠脾脏指数下降,同时显著减少脾脏淋巴细胞总数,降低脾细胞中Th和Tc细胞比率,而SLE(100及200 mg/kg)给药均能不同程度地改善上述指标。与抗肿瘤关系密切的CTL活性测试结果显示,与P815对照组小鼠脾脏的CTL活性相比,拘束应激显著降低小鼠脾脏CTL活性LU10/spleen(P0.01).与应激模型组相比,100及200 mg/kg口服给药SLE后的小鼠脾脏CTL活性LU 10/spleen均有不同程度的提高(P0.05)。此外,研究发现与P815对照组相比应激模型组肝脏Fas/Fas-L mRAN表达比率明显下降(P0.01)。与应激模型组相比,SLE 100和200 mg/kg组小鼠肝脏Fas/Fas-L mRAN表达水平均明显上升,结果表明SLE也可能通过提高Fas/Fas-L mRAN表达水平来达到抵抗应激性肝癌转移的作用。 综上所述,五味子标准提取物SLE可以改善拘束应激负荷造成的小鼠肝脏损伤和肝脏癌转移,其改善机制可能与提高应激负荷机体免疫功能和缓解细胞内的过氧化损伤有关。因此,采用现代科学方法,从抗应激的角度揭示中药五味子标准提取物的肝保护用的科学内涵不仅具有迫切性,也必然形成有益的社会效益。


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