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《大连医科大学》 2012年
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自分泌运动因子在胶质瘤干细胞中的作用及临床意义

李阳  
【摘要】:胶质瘤是最常见和最致命的颅内肿瘤。这些癌症通过对整个大脑的广泛入侵表现出了持续的恶性进展特点,并对传统的放化疗和新的靶向治疗方法具有抵抗力,随着正常脑组织的破坏,最终导致患者的死亡。最近随着在干细胞生物学,细胞信号转导,基因组学和生物信息学方面的进步,我们对恶性胶质瘤在基因,生物学和临床表现方面的理解更进了一步。这些进展为治疗这一难治性疾病提供了新的研究方向和新的疗法,并预示着良好的未来。 恶性胶质瘤根据病理特点和临床表现进行分类和分型。最常见的和最具侵袭性的是胶质母细胞瘤(GBM),世界卫生组织(WHO)规定为IV级,该级别的细胞具有增殖失控,弥漫性浸润的特点,倾向于坏死和强大的血管生成,具有较强的抗细胞凋亡的能力,以及基因组不稳定的特点。顾名思义,“多形”的特点是在细胞病理、转录和基因组水平具有显著的肿瘤异质性。这样的复杂性,加上肿瘤干细胞(CSC)亚群的学说和表观遗传学(EPI),使这一类肿瘤变的很难理解和治疗。尽管实施加强的治疗策略,在过去的十年里,GBM的中位生存期一直保持在12个月左右。 干细胞群体具有独特的性能,它们存在于几乎所有的多细胞生物体的组织内。这些细胞具有寿命长的特点,并具有自我更新能力,并能引起周围组织细胞的再生和更新。以上特点都有可能容易使他们在很多年的存活后发生肿瘤方向的转化。根据“癌症的干细胞起源”假说,干细胞或细胞获得自我更新,积累了长时间的遗传变化的能力,脱离控制自己的环境,并引起癌细胞生长。这可以解释乳腺癌和其他一些癌症的跨肿瘤异质性来源不同的现象。然而,大多数肿瘤细胞的主要组成都基于起源组织,存在不同程度上的分化,即使在远处转移的情况下,这些现象也没有改变。一些分化程度的基础上,组织起源,可即使在远处转移的情况下决定的。肿瘤干细胞理论认为肿瘤干细胞具有干细胞样的特征存在于肿瘤细胞中,支持那些分化表型的非肿瘤干细胞。 本实验通过以U87细胞系为研究载体,对侧群细胞中AMF的表达进行检测,并下调AMF的表达,发现U87肿瘤细胞在侵袭力和干性两个方面都有显著的下降。同时本实验还检测了EGF+61多态性对胶质瘤患病率的影响,并与AMF的表达相关。进一步探讨AMF在肿瘤细胞中的作用,不仅与肿瘤干细胞相关,而且有可能成为肿瘤干细胞新的特异性标记物。 第一部分:AMF在人胶质瘤细胞系U87肿瘤干细胞中的表达 目的:测定AMF在肿瘤干细胞中的的表达。 方法:应用神经干细胞培养基对肿瘤细胞进行富集培养。流式细胞仪SP细胞分析和分选,在U87细胞系中分离肿瘤干细胞,并应用western-blot的方法对干细胞标记物CD133和SOX2进行鉴定,同时测定AMF的表达。 结果:U87细胞在含血清培养基中呈贴壁生长,而在无血清培养基中呈悬浮的肿瘤干细胞球样生长,并都能在相应的培养基中连续传代,更换培养基后其生长方式很快发生转换,重复几次后这种转换能力并不减弱。侧群细胞的鉴定及分选,无血清培养组与完全培养组的SP细胞比例具有统计学差异,p=0.0001。SOX2、CD133以及AMF在侧群细胞和非侧群细胞中的表达,非SP细胞不表达SOX2、CD133以及AMF,分选前细胞组与SP细胞组在三种蛋白的表达上的差异具有统计学意义,P<0.05。 结论:1.U87胶质瘤细胞系中的确存在少量具有增殖潜能和自我更新能力的细胞。2.神经干细胞无血清培养可以富集U87细胞系中的肿瘤干细胞。3.AMF在肿瘤干细胞中具有较高的表达水平。 第二部分:下调AMF对人胶质瘤细胞系U87侵袭力及肿瘤细胞干细胞特性的影响 目的:研究AMF在U87细胞中的作用及其对胶质瘤细胞干性的影响。 方法:应用siRNA化学合成法下调AMF在U87细胞中的表达;应用划痕试验和Transwell试验测定AMF下调对迁移能力的影响;应用流式细胞仪侧群分选测定AMF下调对肿瘤侧群比例的影响;应用细胞成球试验测定AMF下调对肿瘤细胞成球能力的影响。应用western-blot的方法测定AMF下调对Akt,pAKt及SOX2表达的影响。 结果:1.PGI/AMF的mRNA在下调后出现了明显的下降(50%,p=0.0075),并且其表达水平在对照组和假转染组没有发现明显的不同(Fig.1A p=0.4492).通过Western blot的分析,siPGI/AMF在蛋白水平上可以达到大于70%的下调(Fig.1B)。2.在AMF下调的U87细胞系中,其划痕愈合能力被明显的抑制了(p=0.0005)。siAMF可以抑制U87细胞的迁移能力。(p=0.0005)。3.PGI/AMF的下调使U87细胞系中侧群细胞的含量下降。4.siPGI/AMF组比对照组在肿瘤球的数量和大小上具有显著性的减少。siPGI/AMF的细胞与对照组的细胞(P=0.0019)形成肿瘤球的数量相比,大约减少50%。此外,PGI/AMF下调后,形成肿瘤细胞球的大小也显著降低,对照组为197.3±8.090μm,实验组113.0±10.02μm,差异具有统计学意义。5.下调PGI/AMF可以降低Akt的磷酸化水平。PGI/AMF的下调的同时干性相关的蛋白质SOX2表达也发生下调。 结论:PGI/AMF在胶质瘤细胞中的重要性。其表达的下调导致胶质瘤细胞的迁移能力降低和肿瘤成球能力下降。本研究表明PGI/AMF在脑胶质瘤迁移和干细胞生物学中具有重要作用。 第三部分:EGF多态性通过调节AMF的表达影响胶质瘤的发病率 目的:在中国人群中调查表皮生长因子+61G/A基因型与胶质瘤发病率的潜在关联。同时检测表皮生长因子+61G/A基因型与AMF表达水平的关系。 方法:应用PCR-RFLP的方法检测EGF+61的基因型,应用RT-PCR的方法检测AMF的表达水平。 结果:180例胶质瘤和180例正常人的各项因素如表1所示。各组没有差异相关,性别(P=0.50)及年龄(P=0.52)。年龄的标准偏差为46.1岁,胶质瘤组为14.7岁,对照组为45.1-13.3岁。此外,2组没有不同吸烟状况,饮酒,或家族史癌症。其中180例胶质瘤,67(37.2%)为星形细胞瘤,59(32.8%)为神经母细胞瘤,54(30.0%)有其他胶质瘤。基因型和等位基因频率在两组均符合Hardy-Weinberg平衡。AA基因型的胶质瘤患者比对照组有显着较高的频率(OR:2.25;95%CI,1.20,4.21,P=0.01)。 结论:1.EGF+61AA基因型在中国人群中存在较高的胶质瘤患病风险。2.EGF+61AA基因型的患者中,AMF的表达水平较高。
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R739.41

【共引文献】
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