收藏本站
《大连医科大学》 2014年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

血根碱引起的药物—药物相互作用及抗恶性黑素瘤转移的研究

齐晓怡  
【摘要】:背景:血根碱是一种具有抗微生物、抗炎等多种生物学活性的生物碱,因其对多种人类肿瘤细胞系有较强的抑制作用而被推荐为抗癌候选药物。鉴于对中药单体的毒性和药效活性评价是其成药的两大前提因素,因此本研究拟对血根碱的毒性和抗癌活性进行深入的探讨。药物的毒副作用已经被大量文献报道,其产生毒性存在种属差异。血根碱对细胞色素P450酶的抑制与其毒性相关。恶性黑素瘤是高度恶性皮肤肿瘤,可发生早期血行转移,脑和肺等是其主要侵袭、转移器官,该类疾病手术治疗困难,且预后极差。恶性黑素瘤恶性程度高、转移发生早。理想的抗恶性黑素瘤的药物最好既能有效的抑制原发肿瘤的增殖,又能抑制其转移。目前用于抗肿瘤药物筛选的体外模型主要是平面培养,即二维模型。细胞二维培养模型存在一些缺陷:缺乏真实的肿瘤组织的微环境,缺少细胞外基质的支持,肿瘤细胞的贴壁生长使其丧失了某些生物学特性。 目的: 1.研究血根碱是否会诱发经CYP酶抑制的药物-药物相互作用。 2.研究血根碱是否能够抑制人恶性黑色素瘤细胞株451LU的粘附、侵袭、转移能力。 3.建立一种人恶性黑色素瘤细胞株451LU的三维培养模型,对其形态学及功能学进行初步评价,并在此基础上对血根碱的抗肿瘤活性再次进行评价。 方法: 1.通过CYP探针底物反应,对血根碱对CYP酶各个亚型的抑制能力进行评价,继而通过单点失活实验、抑制动力学实验进行可逆和基于时间依赖的抑制动力学参数测定,根据FDA推荐的预测公式推导出体内血根碱药物-药物相互作用程度的预测。 2.用SRB法检测不同浓度血根碱对恶性黑素瘤细胞细胞活力的影响,通过Annexin-V/PI双染流式细胞术检测目标浓度血根碱对恶性黑色素瘤细胞细胞活力的影响。通过transwell肿瘤细胞侵袭实验、细胞伤口愈合实验、基质-细胞粘附实验、内皮细胞增殖实验来检测血根碱对恶性黑色素瘤细胞侵袭、转移、粘附及对内皮细胞增殖的抑制作用。通过real time PCR,Western blot来检测肿瘤转移、粘附、血管生成相关基因和蛋白的影响。Western Blot法检测血根碱对恶性黑素瘤细胞的FAK信号通路的影响。 3.将人恶性黑色素瘤细胞株451LU种植于鼠尾胶原中,使细胞在三维立体条件下生长。通过组织学染色、细胞活性分析及免疫荧光染色对细胞的形态学进行评价,通过DNA含量的测定来反映不同培养条件下细胞增殖的情况,通过real time PCR检测相关基因表达量的差异。通过MTT法评价四种抗癌药物对恶性黑素瘤细胞的细胞活力的影响。 结果: 1.对血根碱是否会引经CYP酶抑制的药物-药物相互作用进行研究首先考察80μM血根碱对CYP各个亚型催化的探针反应的抑制作用,结果显示对于CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP3A4,血根碱对其活性的抑制超过50%,进一步对其抑制的半数抑制浓度(IC50)进行测定。血根碱对其催化的反应产生浓度依赖型的抑制,IC50值分别为4.5、10.2、7.2和3.4μM。选择不同血根碱浓度和探针底物浓度对抑制CYP1A2,CYP2C8,CYP2C9,CYP34的可逆抑制类型和抑制动力学参数进行了测定。用Lineweaver-Burk作图方法来判断可逆抑制类型,用二次作图来计算抑制动力学参数。结果表明,血根碱对CYP1A2, CYP3A4和CYP2C9的抑制类型属于竞争性抑制,而对CYP2C8属于非竞争性抑制。用Lineweaver-Burk作图中的每条线的斜率对血根碱浓度作图,求得可逆抑制常数Ki,CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP3A4Ki值分别为2.7、8.9、3.8和2.0μM。在单点失活实验中,加入NADPH预孵后的血根碱对CYP1A2、CYP3A4活性的抑制百分比分别增加了25.5%和20.3%,对其它CYP亚型的抑制增加的百分比均小于15%。研究发现,血根碱对CYP1A2,CYP3A4催化的反应体现出时间依赖和NADPH依赖的抑制行为。其对两酶的TDI抑制动力学参数KI/kinactvalues分别为13.3/0.087和5.58/0.029min-1μM-1. 2.研究血根碱是否能够抑制人恶性黑色素瘤细胞株451LU的粘附、侵袭、转移能力0.02-50μM血根碱可以显著抑制人恶性黑素瘤451-LU细胞的细胞活力,为避免细胞活力因素对后续实验的影响,分别选择安全浓度、低毒浓度和80%细胞活力的三个浓度,即1μM、1.5μM、2μM三个浓度用于后续实验。Annexin V和PI双染流式细胞术可见1-2μM血根碱对451-LU细胞活力无明显的影响。1-2μM血根碱对451-LU细胞粘附能力均有一定的抑制作用。可以抑制451-LU细胞与基质胶原的粘附作用,且抑制能力呈时间、浓度依赖性。血根碱可以抑制451-LU细胞侵袭、迁移的能力,但各组间未见显著差异。通过SRB方法检测血根碱对人脐静脉内皮细胞增殖的抑制作用,结果显示,nM级别的血根碱可对人脐静脉内皮细胞出现较强的抑制作用。分别选取与肿瘤转移相关的三组蛋白,MMP-2、MMP-2、ICAM-1、VCAM-1、EGF和VEGF-A,将原位恶性黑素瘤WM35与转移株451LU细胞中各蛋白mRNA的表达情况通过realtime-PCR的手段进行检测,结果显示ICAM-1、MMP-2、EGF和VEGF-A的mRNA表达存在显著的增加。1-2μM血根碱均可以抑制ICAM-1,MMP-2, EGF和VEGF-A的mRNA表达。血根碱同样可以抑制ICAM-1,MMP-2蛋白的表达,可以下调FAK及P-FAK的表达。 3.人恶性黑素瘤细胞株451LU三维培养模型传统的二维培养中,3天左右细胞出现增殖,5天左右开始出现凋亡,到第7天已经大部分凋亡,而三维培养条件下,451LU细胞呈肿瘤团状增殖,至14天仍可见良好细胞活性。与传统的二维培养相比,三维培养条件下的细胞增殖能力显著增加。显微镜下可见细胞呈球团状生长,晚期(14天)肿瘤团中央可出现缺氧坏死,与在体肿瘤类似。使用MTT的方法对二维培养条件和三维培养条件下阿霉素、长春碱、紫杉醇和血根碱的抗451LU活性进行检测,在三维培养条件下,阿霉素、长春碱和血根碱各组的IC50值存在不同程度的提升,而紫杉醇组仍旧未检测到抗癌活性。在三维培养条件下,分别选取在二维培养条件下出现显著差异的ICAM-1、MMP-2、EGF和VEGF-A,及其在恶性黑素瘤中存在高表达的WT1、BRAF-V600E,与药物吸收相关的P-gp,与肿瘤细胞脱落相关的KLK7,研究结果发现,在三维培养条件下,MMP2、ICAM-1、BRAF-V600E、p-gp的mRNA表达出现显著的增加。 结论: 1.血根碱对CYP1A2、 CYP3A4和CYP2C9产生了竞争性的可逆抑制作用,对CYP2C8产生了非竞争性的可逆抑制作用。血根碱还对CYP1A2和CYP3A4产生了时间依赖性的抑制。血根碱与CYP1A2、CYP3A4、CYP2C8和CYP2C9的底物共用时可能诱发严重药物-药物相互作用。 2.血根碱可以显著抑制人恶性黑素瘤451LU细胞增殖能力。同时,血根碱可抑制黑素瘤的侵袭转移及血管生成的能力,其抑制侵袭转移的能力可能与下调MMP2、ICAM1、VEGF、EGF的基因、蛋白表达水平相关,血根碱可以下调FAK及磷酸化FAK的表达。 3.黑素瘤451LU细胞在三维培养模式下生长形态发生改变,三维培养的451LU细胞增殖能力较二维显著提高,三维培养的451LU细胞对药物敏感程度下降,三维培养条件下MMP2、ICAM1、p-gp、BRAF-V600E的基因表达水平升高。
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R739.5

手机知网App
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 W.B.Tay;K.B.Lim;;Analysis of non-symmetrical flapping airfoils[J];Acta Mechanica Sinica;2009年04期
2 ;Spectral studies of the interaction between sanguinarine and guanosine[J];Chinese Chemical Letters;2008年12期
3 朱潇鹏;徐庆福;吕胜青;;miR-21与AP-1构成的自我调节环路在脑胶质瘤中的研究进展[J];国际神经病学神经外科学杂志;2013年04期
4 Jun-jun Wang;Rong Zhao;Ji-chao Liang;Yong Chen;;Antidiabetic and Anti-oxidative Effects of Honokiol on Diabetic Rats Induced by High-fat Diet and Streptozotocin[J];Chinese Herbal Medicines;2014年01期
5 孙广卫;张少军;李健;;黏着斑激酶、磷酸酶和张力蛋白同源缺失基因在脑胶质瘤中的表达及相关性研究[J];蚌埠医学院学报;2013年12期
6 徐丽;宫喜;刘卉;宋军;周瑞祥;;褪黑素对小鼠MFC前胃癌细胞ERK、Akt及NF-κB表达的影响[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2014年01期
7 王雪琴;曹丽华;陈正坚;罗军;王红军;涂克华;蒋宏亮;王利群;;用于抗肿瘤药物评价的三维肿瘤细胞体系的构建及性能[J];高分子学报;2014年06期
8 戴翠萍;张徐宁;薛彩萍;季宁东;;冰片对Eca109/DDP细胞耐顺铂的逆转作用[J];广东医学;2014年09期
9 时粒笠;钟德胜;古春萍;余乐;;塞来昔布拮抗卡铂在食管癌细胞的细胞毒作用[J];南方医科大学学报;2014年06期
10 彭飞;彭玲;黄琼瑶;;血根碱调控肿瘤细胞周期机制研究进展[J];湖南中医杂志;2011年02期
中国重要会议论文全文数据库 前5条
1 柳艾姣;石磊;关慧;詹同运;赵树进;;大肠杆菌内表达重组人源细胞色素酶P450[A];共铸医药学术新文明——2012年广东省药师周大会论文集[C];2012年
2 郭海方;许卉;刘珂;;细胞色素P450与药物代谢[A];第九届全国药物和化学异物代谢学术会议论文集[C];2009年
3 李巍;刘勇;何芋岐;张江伟;杨凌;;雷公藤内酯醇的人肝和大鼠肝微粒体中细胞色素P450代谢的研究[A];药用植物化学与中药有效成分分析研讨会论文集(上)[C];2008年
4 黄恺飞;GD zhang;YQ Huang;刁勇;;Wogonin induces apoptosis and downregulates survivin in human breast cancer MCF-7 cells by modulating PI3K-AKT pathway[A];第十一届全国博士生学术年会(生物医药专题)论文集(下册,墙报P25-P48)[C];2013年
5 方罗;吴盈盈;张翀;林能明;;全球抗肿瘤药物研发新进展[A];抗肿瘤药物研究新进展与肿瘤个性化药物治疗论坛论文集[C];2013年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 钟明;博落回主要生物碱的分离、纯化及生物活性研究[D];中南大学;2011年
2 唐建华;三维肝癌类组织体模型建立及肺侵袭关联蛋白筛查[D];复旦大学;2010年
3 董瑞华;百里酚及异百里酚的体外代谢研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年
4 骆益宙;骨髓来源内皮前体细胞与肿瘤新生血管的关系[D];第二军医大学;2005年
5 李爽;乙型肝炎病毒对细胞色素P450同工酶3A4表达的影响[D];第二军医大学;2006年
6 张斌;药物代谢动力学性质评价在新药发现及开发中的应用研究[D];中国协和医科大学;2007年
7 胡会青;盐酸双苯氟嗪的药代动力学和毒代动力学研究[D];河北医科大学;2009年
8 葛睿;DBDCT初步毒代动力学、神经毒性作用及其机制研究[D];山西医科大学;2013年
9 王魏;聚L-谷氨酸/壳聚糖材料在脂肪组织工程以及胆管癌三维培养模型中应用的实验研究[D];山东大学;2013年
10 张斌豪;Smad4缺失通过激活Akt通路增加结直肠癌恶性程度并诱导5-氟尿嘧啶耐药性[D];华中科技大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 方琳乔;两面针中两种生物碱的含量测定方法及离子树脂提取分离工艺研究[D];广西医科大学;2011年
2 任江涛;CCl_4诱导的小鼠急性肝损伤过程中与细胞增殖、凋亡及代谢相关分子的动态变化[D];河南科技大学;2011年
3 王静;Columbin对实验性2型糖尿病大鼠肝脏药物代谢酶CYP450的影响[D];华中科技大学;2011年
4 曲衍清;体外预测己烯雌酚引起药物—药物相互作用的可能性[D];大连医科大学;2011年
5 蔡敏霞;FTY720对胰腺癌细胞增殖和凋亡的作用研究[D];浙江大学;2007年
6 曾本华;洛伐他汀在巴马香猪体内的首过效应研究[D];第三军医大学;2007年
7 吴亚妹;体外三维培养条件下肝癌细胞侵袭、转移的实验研究[D];第四军医大学;2008年
8 高杨;体外预测联苯双酯发生药物相互作用的可能性[D];大连医科大学;2009年
9 杨坡;金属蛋白酶解离素9在胰腺癌发生发展中的作用研究[D];浙江大学;2010年
10 郑义;伴放线放线杆菌对2型糖尿病患者多形核白细胞分泌IL-6和凋亡的影响[D];吉林大学;2010年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 安彩贤,杨广德,叶建涛,符军梅;RP-HPLC法同时测定小果博落回中血根碱和白屈菜红碱的含量[J];中成药;2001年11期
2 柯学;黄志峰;董晓卉;许颖;;血根碱脂质体制备工艺研究[J];中国天然药物;2008年06期
3 刘铭;彭飞;刘年猛;孙慧;彭玲;黄琼瑶;;血水草血根碱杀灭钉螺作用的研究[J];实用预防医学;2009年03期
4 欧阳文;满意;;博落回提取物中血根碱和白屈菜红碱的含量测定[J];化学工程师;2008年10期
5 贝俊宏;柯学;黄志峰;平其能;;血根碱脂质体的制备与大鼠体内药动学[J];药学与临床研究;2010年01期
6 肖竦;;高效毛细管电泳测定小果博落回中血根碱和白屈菜红碱[J];中国实验方剂学杂志;2011年14期
7 徐加英;焦旸;陈菊;车俊;许志平;胡旭东;秦立强;朱巍;曹建平;樊赛军;;血根碱对人类宫颈癌细胞生长和转移的抑制作用[J];苏州大学学报(医学版);2009年05期
8 左金梁;李丹;赵春杰;季光辉;;RP-HPLC法同时测定胃痛平糖浆中血根碱和小檗碱的含量[J];沈阳药科大学学报;2008年04期
9 刘爱玲;陈玉秀;刘红英;石建云;张盛;;博落回果实药材质量标准研究[J];现代生物医学进展;2009年07期
10 刘铭;田大伦;刘年猛;彭飞;孙慧;彭玲;;血水草血根碱杀螺效果及对钉螺头足部MDA活性的影响[J];中南林业科技大学学报;2009年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 吕培;谢龙观;徐效华;;血根碱的全合成及其衍生物杀菌活性研究[A];中国第五届植物化感作用学术研讨会论文摘要集[C];2011年
2 姚嘉赟;周志明;李喜莲;潘晓艺;郝贵杰;徐洋;茹红顺;尹文林;沈锦玉;;小果博落回杀灭鱼类小瓜虫活性成分的研究[A];渔业科技创新与发展方式转变——2011年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
3 袁劲松;古桂花;杨大坚;叶敏;果德安;;高效液相法测定夏天无药材中11种有效成分的含量[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
4 钟明;曾建国;陈应庄;谈满良;罗炼辉;;博落回中微量生物碱的研究进展[A];2007年中华中医药学会第八届中药鉴定学术研讨会、2007年中国中西医结合学会中药专业委员会全国中药学术研讨会论文集[C];2007年
5 童德文;李兆才;许信刚;王志昇;赵晓民;;天然生物碱诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会论文集[C];2009年
6 梁锋;张成功;马铭;陈波;姚守拙;;乳状液膜分离提取博落回中四种生物碱的研究[A];第四届海峡两岸分析化学学术会议论文集[C];2006年
7 彭桦;李玉慧;刘星星;徐伟箭;马铭;;功能化磁性微球合成及分离提取博落回中生物碱研究[A];2009年全国高分子学术论文报告会论文摘要集(下册)[C];2009年
8 姚嘉赟;沈锦玉;;博落回杀灭小瓜虫活性成分的研究[A];2010年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
9 崔征;齐美玲;殷军;朱光;;东北延胡索的化学成分及近缘植物的植物化学分类学[A];中国植物学会七十五周年年会论文摘要汇编(1933-2008)[C];2008年
10 杜方麓;;血水草的生物碱及药材采收期[A];中国自然资源学会全国第四届天然药物资源学术研讨会论文集[C];2000年
中国博士学位论文全文数据库 前8条
1 伍勇;血根碱在大鼠、猪和鸡的体外代谢研究[D];湖南农业大学;2013年
2 齐晓怡;血根碱引起的药物—药物相互作用及抗恶性黑素瘤转移的研究[D];大连医科大学;2014年
3 徐加英;血根碱抗宫颈癌作用及其机制的研究[D];苏州大学;2013年
4 王慧;血根碱对大鼠小肠平滑肌收缩的抑制作用及信号传导通路研究[D];湖南农业大学;2012年
5 李俊芬;喹啉、异喹啉类生物碱发光探针与ctDNA相互作用的研究[D];山西大学;2008年
6 罗旭彪;生物碱的分离分析及其液相色谱保留机理的研究[D];湖南大学;2006年
7 张敏;苯并[c]菲啶和橙酮类化合物的设计、合成与生物活性研究[D];南开大学;2009年
8 曾建国;基于代谢框架和鲜药材的炮制“幼朴”与厚朴的等效性研究[D];湖南中医药大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 芦程;血根碱杀灭指环虫机制及对金鱼免疫毒理研究[D];西北农林科技大学;2013年
2 张鸿;血根碱对细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用研究[D];内蒙古工业大学;2010年
3 崇羽;氧化石墨烯—血根碱的可控装载及生物活性研究[D];苏州大学;2013年
4 毛鹏;博落回生物碱成分及杀螨活性研究(Ⅰ)[D];西北农林科技大学;2004年
5 赵静;黄芩苷—血根碱离子对化合物纳米药物的制备[D];湖南农业大学;2012年
6 漆俊;血根碱对大鼠肠平滑肌细胞活性和细胞凋亡的影响[D];湖南农业大学;2012年
7 张斐;博落回及银杏叶中有效成分的提取、制备分离[D];湖南师范大学;2004年
8 徐丽;血根碱—黄芩苷、白屈菜红碱—黄芩苷离子对化合物制备工艺及活性研究[D];湖南中医药大学;2012年
9 王静慧;血根碱对细菌生物被膜的作用研究[D];浙江工商大学;2012年
10 吴飞;基于异喹啉类生物碱小分子与AP-DNA相互作用的DNA识别[D];浙江师范大学;2013年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026