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《大连医科大学》 2014年
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三叉神经系统参与实验性牙髄炎症的分子调控机制的研究

田英  
【摘要】:目的:牙髓是一种富含神经纤维的组织,这些神经纤维来源于三叉神经节初级感觉神经元,含有P物质、降钙素基因相关肽(Calcitonin Gene-Relatcd Pepide,CGRP)、神经激肽A等神经肽。有学者认为,CGRP不仅是重要的疼痛相关因子,它也可以通过调节神经与血管的活动而参与牙髓急慢性炎症过程,因此牙髓炎症在很大程度上是神经源性所介导的炎症。最近的研究发现,牙髓组织中免疫活性细胞如巨噬细胞与CGRP神经纤维非常接近,并可见细胞与神经末梢膨大处的接触,巨噬细胞被认为是在免疫系统和神经系统间发挥双向作用的核心细胞,提示牙髓组织中存在着神经与免疫系统的相互作用。新兴的概念指出,免疫细胞、神经胶质细胞和神经元形成完整的网络性调节通路,在免疫应答及神经调节通路兴奋性过程中,共同发挥作用。目前,对于牙体牙髓炎症及其痛觉过敏过程的神经免疫调节网络机制仍不明确,有待深入研究。本实验采用完全弗氏佐剂(Complete Freund's Adjuvant,CFA)诱导建立大鼠实验性牙髓炎症动物模型,应用免疫荧光和免疫组化法标记大鼠牙髓炎症过程中炎性因子及神经系统可塑性相关因子的动态表达,探讨三叉神经系统参与大鼠牙髓炎症时神经系统和免疫系统的相互作用,为深入了解神经系统参与牙髓炎症的各种生理、病理改变的调节提供实验参考。材料和方法:选取成年雄性Sprague-Dawley大鼠24只,右下颌第一磨牙牙合面行开髓术后,髓腔内封入完全弗氏佐剂及荧光金。左侧下颌第一磨牙为正常对照组。建模后大鼠分为两组:(1)分别于术后24小时、72小时、1周、2周、4周和6周,行多聚甲醛心脏灌流固定动物后,取双侧三叉神经节及双侧下颌骨组织脱钙后,分别制作冰冻切片。免疫组织化学染色观察炎性相关因子:核转录因子κB(Nuclear Factor κB,NF-κB)及肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-alpha,TNF-α)在牙髓及周围组织中的表达。免疫荧光染色检测大鼠三叉神经节中CGRP、CD68的动态表达。(2)上述时间点各选取两只大鼠,取双侧三叉神经节,提取总RNA,采用反转录 PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)半定量分析方法,从mRNA水平检测三叉神经节中CGRP及胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)的动态表达。结果:1、组织病理学检测可见,大鼠右下颌第一磨牙髓腔封入CFA24小时后,冠髓以开髓点为中心形成坏死区,成牙本质细胞排列紊乱、空泡性变。随炎症发展,牙髓炎症由冠髓向根髓蔓延,至CFA诱发大鼠牙髓炎症6周后,冠髓和根髓组织完全坏死、脱落。提示大鼠实验性牙髓炎动物模型建立。CFA诱发大鼠牙髓炎症2周后,可见根尖周组织局部炎性渗出,大量中性粒细胞侵润,炎性浸润向周围牙槽骨扩散蔓延,形成局限性牙槽突骨髓炎,至CFA诱发大鼠牙髓炎症6周,可见成纤维细胞增生形成肉芽组织,提示大鼠牙髓炎向根尖周扩散引发根尖周炎症。2、免疫组织化学染色及免疫荧光染色结果显示,右下颌第一磨牙冠髓及根髓组织中均有NF-κB阳性表达。对照侧及实验侧第二、三磨牙未见NF-κB阳性细胞表达。CFA诱导大鼠实验性牙髓炎症24小时后,右下颌第一磨牙以开髓点为中心形成坏死区及炎性渗出区,临近冠髓组织内可见散在的NF-κB阳性细胞,根髓正常,未见NF-κB阳性细胞;1周后NF-κB阳性细胞增加,向根管口附近移行,根髓正常,未见NF-κB阳性细胞;2周及4周后,冠髓形成明显的炎性渗出灶,NF-κB阳性表达明显增多,根髓处可见NF-κB阳性表达。根尖周炎浆液性渗出区炎性细胞大量表达NF-κB及TNF-α。3、免疫荧光染色结果显示,CFA诱发大鼠牙髓炎症24小时后,三叉神经节可见大量CD68免疫阳性细胞。CD68免疫阳性细胞形态由小圆形或不规则细胞形态,逐渐变化为有部分伪足伸出,直至1周后其伸长的伪足在神经元周围形成明显的网状结构,此后CD68免疫阳性细胞伪足逐渐减少,细胞形态恢复至圆形或扁圆形状态,提示神经节内巨噬细胞活化反应过程。荧光光密度值分析显示,CD68免疫反应性荧光产物的平均光密度强度在炎症刺激24小时后开始升高,72小时持续上升,1周后达到峰值,2周后下降,至4周持续下降,6周后趋于稳定。4、免疫荧光染色结果显示,CFA诱发大鼠实验性牙髓炎症后,TG神经元大量表达CGRP,其分布与正常对照组TG相似;CGRP阳性细胞数统计分析显示,炎症刺激2周及4周后,TG单位面积内CGRP免疫反应性神经元数明显低于正常对照组(p0.05)。RTPCR半定量分析结果显示,牙髓炎症后24小时,TG内mRNA水平的CGRP表达高于正常对照组,差异且具有统计学意义(p0.01);在72小时后CGRP表达水平达到峰值,与对照组相比具有显著差异(p0.001)。5、RT-PCR半定量分析结果显示,CFA诱发大鼠牙髓炎症后24小时,胶质纤维酸性蛋白GFAP表达明显增加,与对照组相比具有显著性差异(p0.001);72小时后,GFAP的表达量恢复至正常,持续至6周,与对照组相比无统计学意义。结论:1、在大鼠实验性牙髓炎模型中,TNF-α和NF-κB在牙髓及根尖周组织高表达,提示炎症因子TNF-α和NF-κB参与牙髓炎症的发生和发展2、大鼠牙髓炎症时TG中CGRP、CD68、GFAP的表达增强,提示三叉神经系统通过神经元可塑性变化、巨噬细胞及卫星胶质细胞的活化反应参与了调控牙髓炎症的发生发展。3、牙髓炎症及炎性痛觉过敏过程中存在神经系统和免疫系统的相互作用及级联反应。
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R781.31

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