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《大连医科大学》 2018年
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亚牛磺酸代谢通路检测方法研究

衣博  
【摘要】:目的:神经胶质瘤是人体内最常见一种中枢系统神经肿瘤,发病率约占中枢神经系统的一半以上。依据其病理表现的不同,一般将其分为4个级别(Ⅰ~Ⅳ)。神经胶质瘤虽然在人体肿瘤总数发病率较低,但是其由于手术难以完全切除,术后易复发,导致其死亡率一直居高不下,目前对神经胶质瘤的诊断存在一些困难,目前传统的诊断方法依旧依赖手术取病理活检,手术过程中取病理组织经机器脱水浸蜡,包埋成蜡块进行切片、烤片,后经染色油镜下观察,进行诊断分期,取病理组织为有创操作,对患者损伤较大,对病理医师水平要求较高导致了神经胶质瘤诊断具有一定差异。由于取病里组织是一种有创检查,不仅会给患者带来痛苦,严重者会造成术后的出血从而导致颅内高压而危及患者生命,并且有的患者由于病情复杂也不能取病理组织活检。例如:患者有出血倾向,重度高血压,颅内感染等。代谢组学是通过对生物小分子代谢物定性和定量的分析,来揭示生物系统中错综复杂的生物调节机理。代谢产物是各种生理病理过程的最终产物,最能直接的反应机体的状态。神经胶质瘤的发生于发展与细胞内的代谢有着密不可分的关系,本实验的研究目的就是使用代谢组学的方法,采用液相色谱质谱(LC-MS)联用技术来对神经胶质瘤的恶性程度做出初步诊断,揭示这些代谢物与疾病发展中的联系,协助临床对神经胶质瘤恶性程度在不进行病理活检的前提下有一个初步的诊断,从而减轻患者经济和心理上的负担。此项研究是从代谢组学的角度来解释代谢物与神经胶质瘤恶性程度的关系。方法及验证:与神经胶质瘤恶性程度有关的代谢物需要分别采用两种不同的衍生方法对样品进行样品衍生,分别使用不同的衍生试剂,本实验采用Acc QTagderivatization kits、N-ethylmaleimide(NEM)分别对亚牛磺酸代谢通路及还原型谷胱甘肽进行衍生。亚牛磺酸代谢通路采用液相色谱质谱(LC-MS)联用技术对神经胶质瘤细胞(U251)分析:样品衍生采用Acc QTagderivatization kits,将低压冻干样品取出恢复至室温,向冻干样品中加入70μL的硼酸盐缓冲液,置于涡旋仪上涡旋30s,再在向样品中加入20μL的衍生试剂,涡旋10s,放入离心机14000prm离心30s,取出后室温放置1分钟后,放入电子恒温水浴箱中55℃水浴衍生10min。还原型谷胱甘肽的检测采用液相色谱质谱(LC-MS)联用技术对神经胶质瘤细胞(U251)分析:首先称取还原型谷胱甘肽0.0061g溶解在1ml 50%甲醇水溶液中,再称取N-ethylmaleimide(NEM)0.030g溶解在1ml 50%甲醇水溶液中,将两者混合,置于涡旋仪上涡旋30s,室温放置45分钟,衍生完毕后即可上机检测。方法建立后我们要制作标准曲线,评估方法的日内、日间精密度及细胞内标回收率,日内精密度一般控制在5%以内,但是不能超过10%;日间精密度控制在15%即为合格。加标回收率考察的是前处理和上仪器测试全过程中待测物质的预处理情况(包括是否全部从样品中提取出来,是否在预处理过程中有损失或污染),以此来判断实验方法的可行性,加标回收率=加标后细胞标准物质量-加标前细胞标准物质量/加标物质量,加标回收率按照本实验室规定90%-110%为合格。验证数据显示该方法对5个AQC衍生化氨基酸具有良好的线性相关系数(0.9927~0.9997);重复性RSD为2.5%~8.6%;日内和日间精密度的RSD分别为3.41%~9.53%和6.23%~9.23%;细胞加标回收率为93%~106%。GSH和GSSH相关系数分别为0.9997和0.9869,日内精密RSD分别为5.41%和9.53%,日间精密度RSD分别为7.23%和8.46%,加标回收率分别为103%和96%。结果:通过对本实验方法进行方法学评价,对实验方法线性回归分析、日内精密度及日间精密度,细胞内标回收率进行综合评估,本实验所建立起的实验方法能够对神经胶质瘤细胞(U251)代谢物种中还原性谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽,亚牛磺酸、牛磺酸、胱氨酸、半胱氨酸、半胱胺亚磺酸进行绝对定量检测。结论:代谢组学可以为评估神经胶质瘤的恶性程度提供一种新的检测方法,通过测定细胞内相应代谢物含量的变化来对神经胶质瘤的恶性程度有一个初步的诊断。同时可以用于评估神经胶质瘤患者术后疗效,对预后有一个初期的判断,也可以为临床评估神经胶质瘤良恶性提供一个新的思路。
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R446.1

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