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《大连医科大学》 2019年
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壳寡糖促进肠道乳酸杆菌优势生长及T细胞增殖

房慧  
【摘要】:背景:壳寡糖是从海洋贝壳类等生物体壳中提取的由2~8个氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的寡糖。其具有多种生物活性,如抗感染、抗肿瘤、抗病毒、免疫调节等。一般认为,寡糖中只有单糖和双糖可经消化道吸收,由于人体内没有可水解β-1,4糖苷键的水解酶,以至于聚合度大于2的寡糖都不能够被吸收。人的胃肠道内寄居着种类繁多的微生物,这些微生物统称为肠道菌群。肠道菌群按一定的比例组合,各肠道菌之间相互制约,互相依存,在质和量上形成一种生态平衡。肠道菌群通过其中占主导作用的共生菌的活动,抑制致病菌的生长,同时阻止致病菌透过这层屏障进入机体。而肠道菌群的失调,则会引起一系列的免疫相关性疾病。正常的肠道菌群可以分解利用机体所不能降解的物质,并通过对淋巴细胞的影响,调节机体免疫。目前关于肠道菌群利用壳寡糖并进一步影响免疫功能的研究还没有被报道。目的:研究壳寡糖对T细胞增殖的调节作用,通过确定特异性利用壳寡糖并优势生长的肠道菌群来深入探讨,为后续开发提供理论基础。方法:1.壳寡糖对肠道菌群的影响16只健康雄性Babl/c小鼠随机分为2组:正常对照组(100μl/day的无菌水灌胃)和壳寡糖组(100μl/day的0.1g/ml的壳寡糖溶液灌胃),由于壳寡糖是用无菌水溶解的,因此正常对照组小鼠需灌胃等体积的溶剂,即100μl/day的无菌水。随后,收集小鼠粪便,进行壳寡糖对肠道菌群影响的研究。通过变形梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)初步检测两组小鼠肠道菌群的分布,进一步地,利用16s高通量测序检测具体变化的特异菌。通过招募志愿者,收集志愿者试吃壳寡糖前后的粪便样本,进行RT-PCR检测特异菌的变化。2.壳寡糖对小鼠免疫功能的调节作用16只健康雄性Babl/c小鼠随机分为2组:正常对照组(100μl/day的无菌水灌胃)和壳寡糖组(100μl/day的0.1g/ml的壳寡糖溶液灌胃),由于壳寡糖是用无菌水溶解的,因此正常对照组的小鼠需要灌胃等体积的溶剂,即100μl/day的无菌水。随后进行壳寡糖对小鼠免疫功能调节作用的研究。通过流式细胞术检测小鼠脾脏中各免疫细胞所占比例,并通过统计学分析其统计学意义;通过RT-PCR检测小鼠脾脏中免疫相关的各细胞因子的mRNA表达水平。3.壳寡糖对乳酸杆菌生长及T细胞增殖的研究选择无糖培养基培养乳酸杆菌,并额外添加不同浓度的壳寡糖0μg/ml,1μg/ml,10μg/ml,100μg/ml和1000μg/ml),观察其对于乳酸杆菌生长状态的影响。通过酶标仪测定595 nm处OD值,连续记录50h,绘制乳酸杆菌生长曲线。选择壳寡糖溶液,完全培养基培养的乳酸杆菌上清液,无糖培养基培养的乳酸杆菌上清液和乳酸杆菌+壳寡糖共培养的上清液刺激T细胞,通过MTT比色法和CFSE流式荧光标记法检测其增殖情况。4.壳寡糖对高脂饮食诱导的小鼠高血糖血脂水平的保护作用研究15只健康雄性ICR小鼠随机分为3组:正常对照组(给予正常饲料和100μl/day的无菌水灌胃),高脂饮食组(给予高脂饲料和100μl/day的无菌水灌胃),高脂饮食+壳寡糖组(给予高脂饲料和100μl/day的0.1g/ml的壳寡糖溶液灌胃)。按照相应分组进行操作,取血清样本进行血清血脂水平的ELISA检测。结果:1.壳寡糖对肠道菌群的影响通过DGGE检测发现,正常对照组和壳寡糖组小鼠的肠道菌群分布显著不同,且各组聚为一类,说明壳寡糖改变了小鼠的肠道菌群分布;通过切胶测序进一步发现了壳寡糖组中相对含量增多的菌:乳酸杆菌属和嗜黏蛋白阿克曼氏菌属。16s高通量测序发现了壳寡糖灌胃后具体变化且差异显著的菌种——乳酸杆菌。我们招募了试吃壳寡糖胶囊的志愿者,收集其服用壳寡糖胶囊前后的粪便,提取DNA,用RT-PCR的手段检测其粪便中乳酸杆菌的变化,我们发现,服用壳寡糖胶囊后,志愿者粪便中乳酸杆菌的相对量显著增加。2.壳寡糖对小鼠免疫功能的调节作用通过对小鼠全脾细胞进行荧光抗体染色,采用流式细胞术检测各免疫细胞的分布情况,壳寡糖组小鼠脾脏中的CD3~+T细胞的所占比明显高于正常对照组;随后通过RT-PCR手段检测发现壳寡糖组小鼠脾脏中细胞因子IL-2、IL-4、TNF、INF-α的mRNA表达水平,与正常对照组相比,无明显差异。3.壳寡糖对乳酸杆菌生长及T细胞增殖的研究通过绘制乳酸杆菌生长曲线,我们发现,壳寡糖可以显著促进L.gasseriJCM1131和L.brevisDM9218的生长。当培养基中添加壳寡糖的浓度为0μg/ml~100μg/ml时,L.gasseriJCM1131的生长趋势与壳寡糖浓度呈现正相关性;当培养基中添加壳寡糖的浓度为0μg/ml~1000μg/ml时,L.brevisDM9218的生长趋势与壳寡糖浓度呈现正相关性;而L.caseiCGMCC1.2435(ATCC334),本实验中所涉及的壳寡糖的浓度并不能改变其生长状态。通过MTT和CFSE法检测T细胞增殖,我们发现,给予乳酸杆菌与壳寡糖共培养上清液处理的T细胞有明显的增殖现象,而单一的给予壳寡糖溶液或完全培养基培养的乳酸杆菌上清液以及无糖培养基培养的乳酸杆菌的上清液均不能引起T细胞的增殖。4.壳寡糖对高脂饮食诱导的小鼠高血脂水平保护作用研究通过ELISA检测,血清中甘油三酯、胆固醇和极低密度脂蛋白的情况,给予壳寡糖处理的高脂饮食组明显改善了血脂水平,且摄食量下降,饮水量提高,体重下降明显。结论:本实验研究发现壳寡糖可以促进肠道中乳酸杆菌的优势生长及T细胞增殖。
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R965

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