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《大连医科大学》 2019年
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miR-29b-3p通过IL32-pAKT通路抑制口腔鳞状细胞癌细胞的迁移和侵袭

何建亚  
【摘要】:目的:口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)是高侵袭性肿瘤,易向区域淋巴结转移,晚期可发生远处转移。本实验组已经证实OSCC侵袭前沿细胞中mi R-29b-3p的表达量降低。本研究的目的是探究mi R-29b-3p对OSCC侵袭前沿细胞迁移和侵袭能力的影响,并探究其作用机制。方法:OSCC细胞株UM-SCC6是清华大学协和医学院馈赠,本实验组已利用微流控芯片模型筛选UM-SCC6细胞株获得了OSCC侵袭前沿细胞并命名为UM-SCC6-M。在光镜下观察UM-SCC6和UM-SCC6-M的细胞形态,利用划痕实验和Transwell小室侵袭实验考察两种细胞迁移和侵袭能力,用Western blot检测β-CATENIN,AKT,p AKT等迁移侵袭相关蛋白标志物在两细胞中的表达,利用RT-q PCR验证mi R-29b-3p的表达。在两种细胞中进行mi R-29b-3p mimic/inhibitor的转染并用RT-q PCR检测转染效率后,考察mi R-29b-3p对UM-SCC6-M和UM-SCC6迁移和侵袭能力的影响。基于Western blot的结果,在UM-SCC6和UM-SCC6-M中,以及经过mi R-29b-3p inhibitor转染的UM-SCC6中加入AKT抑制剂MK-2206,考察其迁移和侵袭能力的变化。为深入了解mi R-29b-3p在OSCC中的作用机制,通过全基因表达谱分析预测mi R-29b-3p的下游靶基因。基于测序结果,利用RT-q PCR和Western blot检测UM-SCC6和UM-SCC6-M中IL32在基因和蛋白水平的表达,并检测mi R-29b-3p在基因和蛋白水平对IL32的调控能力。然后,在两细胞中分别进行IL32过表达和敲低质粒的转染,在检测转染效率后,利用划痕实验和Transwell小室侵袭实验考察IL32对UM-SCC6和UM-SCC6-M迁移和侵袭能力的影响,并一同考察MK-2206对IL32过表达后的UM-SCC6迁移和侵袭能力的影响。同时,检测IL32质粒转染各组细胞中AKT和p AKT蛋白表达量的变化。最后,在两细胞中进行mi R-29b-3p inhibitor/mimic和IL32的共转染,利用划痕实验和Transwell小室侵袭实验考察IL32对mi R-29b-3p的回复作用,并用Western blot检测各组细胞中AKT和p AKT蛋白表达的变化。结果:观察细胞形态,UM-SCC6呈“铺路石”样,细胞间连接紧密,成团块状生长;而UM-SCC6-M呈“成纤维状”,细胞间连接较为松散,个别细胞有伪足。划痕实验和Transwell侵袭实验显示UM-SCC6-M的迁移和侵袭能力均高于UM-SCC6。Western blot结果显示,UM-SCC6-M中SNAI1,p AKT等表达量较高;β-CATENIN,TWIST1,MMP2,AKT等表达量相差不大;p MEK表达量较低。同时RT-q PCR结果验证了UM-SCC6-M中的mi R-29b-3p表达量较低。在验证了mi R-29b-3p mimic/inhibitor的转染效率后,证实mi R-29b-3p mimic能够抑制UM-SCC6-M的迁移和侵袭,mi R-29b-3p inhibitor具有相反的作用。MK-2206能够抑制两细胞的迁移和侵袭能力,且能抑制mi R-29b-3p inhibitor的调控作用。全基因表达谱分析显示,IL32是mi R-29b-3p影响OSCC迁移和侵袭的下游靶基因。RT-q PCR和Western blot结果显示UM-SCC6-M中IL32在基因和蛋白水平表达量较高且mi R-29b-3p可在转录后水平调节IL32的表达。验证了IL32质粒转染效率后,证实IL32能够促进UM-SCC6的迁移和侵袭。AKT抑制剂MK-2206的加入证实IL32通过AKT信号通路发挥作用。最后,划痕实验和Transwell小室侵袭实验证实,IL32可回复mi R-29b-3p对OSCC细胞迁移和侵袭能力的影响。mi R-29b-3p inhibitor/mimic和IL32共转染的Western blot结果显示,IL32能够回复mi R-29b-3p对两细胞中AKT磷酸化水平的调控。结论:综上所述,OSCC侵袭前沿细胞中mi R-29b-3p的表达下调,mi R-29b-3p通过IL32-p AKT信号通路抑制OSCC细胞的迁移和侵袭。
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R739.8

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