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曲格列酮肝细胞毒性作用及其机制研究

王堃  
【摘要】: 曲格列酮(troglitazone)属于噻唑烷二酮类(thiazolidinedione),是新型口服胰岛素增敏剂,用于Ⅱ型糖尿病的治疗。该药通过过氧化物酶体增殖体激活的γ受体(peroxisome proliferator-activated γ receptor,PPAR_γ)而抑制TNF-α信号转导作用,致使血糖降低,缓解胰岛素抵抗。据统计,曲格列酮自1997年在美国上市以来,引起大约40名患者发生急性肝功能损伤,导致26名患者因肝功能严重衰竭死亡,部分肝功能损伤的患者需要肝脏移植。肝脏病理检查结果显示该药引起肝细胞坏死和纤维化病变。2000年美国FDA已将曲格列酮撤出市场。到目前为止,曲格列酮肝脏毒性作用的机理尚不清楚,有人认为其肝脏毒性作用可能与特异质反应(idiosyncratic reaction)有关。为了进一步了解曲格列酮对肝脏的损害作用以及其可能的中毒机制,为防治中毒和新药开发提供参考依据,我们进行了以下方面的研究: 第一部分 曲格列酮细胞毒性作用及其对大鼠肝细胞的氧化性损伤 目的:用原代大鼠肝细胞模型和不同来源建株细胞系,观察比较曲格列酮在大鼠肝细胞和不同细胞系毒性作用的剂量-效应关系。观察谷胱甘肽合成抑制剂丁硫堇磺氧亚胺(D,L-buthionine-S,R-sulfoximine,BSO)及抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)对曲格列酮肝细胞毒性的影响。同时进一步研究曲格列酮对原代大鼠肝细胞的氧化性损伤作用,探讨曲格列酮肝细胞毒性的可能机制。方法:用4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate(WST-1)比色法和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放法检测曲格列酮的细胞毒性作用以及BSO、NAC对曲格列酮细胞毒性的影响。用荧光检测法、生物发光法、Annexin-V-FLUOS/Propidium iodide(PI)共标记和荧光染色等方法,观察曲格列酮对肝细胞的氧化性损伤作用,探讨曲格列酮肝细胞毒性的可能机制。结果:曲格列酮的细胞毒性呈显著的时间-依赖和剂量-依赖性。作用5小时后,其在原代培养大鼠肝细胞的IC_(50)值最低,并与其对HepG2细胞的IC_(50)值接近;与大鼠肝细胞相比,曲格列酮在 Hela细胞和3T3细胞的毒性作用明显减弱,其在Hela细胞和3T3细胞 的ICS。值分别约为原代肝细胞的4倍和8倍。BSO能明显加重曲格列酮 的肝细胞毒性作用,NAC则能有效预防其细胞毒性作用。与对照组细胞 相t匕,曲格flJ酮50林M作用。,5小时一3小时后可诱导活性氧(reaetive oxygen sPeeies,ROS)生成增加,作用5小时后ROS未检出。曲格#lJ酮 引起肝细胞还原型谷肤甘肤(redueed glutathione,GSH)水平显著降低, 该作用呈时间和剂量依赖性。曲格列酮50林M使肝细胞腺昔三磷酸 (adenosine triphosphate,ATp)水平和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)水平比对照细胞显著降低;不同剂量的曲格 列酮作用5小时后肝细胞凋亡发生率和坏死发生率均随浓度的增高而增 加,呈明显的剂量一效应关系。结论:(l)曲格列酮对大鼠肝细胞的细胞 毒性作用强于其对细胞系,尤其是非肝细胞来源的细胞系的细胞毒性作 用,提示,曲格列酮对大鼠肝细胞的细胞毒性作用可能与肝细胞细胞色 素P45o(eytoehrome P45o,eYP45o,eYP)氧化酶催化生成活性代谢中间 体有关。(2)曲格列酮的肝细胞毒性可能与细胞内GSH氧化还原状态有 关。(3)曲格列酮可以诱导肝细胞ROS生成增加,并使GSH水平显著 降低,提示曲格列酮可以引起肝细胞氧化性损伤。(4)曲格列酮50林M 可显著减少肝细胞ATP的生成,并伴随MMP明显降低,提示肝细胞线 粒体损伤。(5)曲格列酮诱导大鼠肝细胞凋亡和坏死发生,该作用呈明 显的剂量依赖性。曲格列酮所致肝细胞凋亡和坏死可能与氧化性损伤有 关,有待进一步研究证实。线粒体损伤是曲格列酮肝细胞毒性的原因或 仅为细胞损伤的后果仍需进一步研究证实。 第二部分曲格列酮对肝微粒体CYP450氧化酶的抑制作用目的: 研究曲格列酮对肝微粒体CYP45o氧化酶的抑制作用并探讨其与肝毒性 的关系。方法:应用高效液相色谱(high pressure liquid ehromatography, HPLC)法测定曲格列酮和阳性抑制剂对肝微粒体皋酮一6p一轻化酶、咪达 哇仑一1气轻化酶(CYP3A4)、7一乙氧基一试卤灵一O一脱乙基酶(CYPIA)、 丁吠洛尔轻化酶(CYPZD)和甲苯磺丁脉轻化酶(CYPZC819)活性的抑 制作用。结果:曲格列酮对肝微粒体咪哒哇仑一1气经化酶和甲苯磺丁服经 化酶活性具有抑制作用;其对肝微粒体辜酮一6p一轻化酶、7一乙氧基一试卤 灵一O一脱乙基酶和丁吠洛尔轻化酶活性无抑制作用。结论:曲格列酮对肝 微粒体CYP3A4和CYPZC819的抑制作用可能引起其自身血药浓度增高, 加重或诱发其肝毒性;同时,曲格列酮对微粒体酶的抑制作用可能引起 药物相互作用,诱发或加重肝损伤。 第三部分 曲格列酮对原代培养大鼠肝细胞CYP450氧化酶的诱导 作用及其与肝细胞毒性的关系 目的:研究曲格列酮对原代培养大鼠肝 细胞CYP3A、CYPIA和 CYPZB的诱导作用,并初步探讨药酶诱导作用 与其肝毒性的关系。方法:采用 T&qffisllRTPCR、W6StCrnblot及 HpLC


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