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《大连医科大学》 2003年
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顺铂细胞毒性及大黄素预防作用分子机制

代智  
【摘要】: 前言 顺铂(cis-diamminedichloroplatinum,CDDP)是当前临床使用的主要抗癌药物之一,治疗卵巢癌、睾丸癌、膀胱癌及头颈部癌等有很好的疗效。但是,CDDP作为一种细胞毒性药物,在治疗肿瘤的同时,亦可对正常组织如肾脏、周围神经等造成损害,其中,肾毒性是限制其临床用药剂量的主要因素。有关CDDP细胞毒性的机理尚不十分清楚。一种观点认为,脂质过氧化损伤是CDDP细胞毒性的机理之一,CDDP可通过产生活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),耗竭细胞内还原型谷胱甘肽(GSH),抑制抗氧化物酶活性,最终造成肾毒性;另一种观点认为,CDDP可与细胞内DNA结合生成Pt-DNA加合物,这种加合物可抑制DNA合成,促使细胞凋亡发生。本研究从细胞、分子水平应用生物化学、分子生物学技术探讨CDDP细胞毒性机制,为进一步阐明CDDP毒性机理提供实验依据。大黄素(emodin,EMD),是中药大黄和何首乌中的有效成分,具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抑菌、扩张血管、免疫抑制等多种药理作用。研究表明,EMD能增强正常细胞经CDDP诱导的DNA损伤的修复,起到预防作用,其中,切除修复基因ERCC1表达增强和Ca~(2+)调节可能参与这一修复过程。EMD对CDDP细胞毒性预防作用其他机制方面的研究很少。本研究从CDDP损伤机制入手探讨EMD的预防作用机理,这为今后更深入研制能减少CDDP毒副作用新药做了很好铺垫,同时也为临床工作者更好的应用EMD提供了科学依据。 方法 本实验以体外培养的人胚肺成纤维细胞WI-38作为研究对象。将WI-38细胞以一定浓度接种至培养瓶或培养板内,待细胞生长至融合状态时,给予不同浓度的CDDP处理,然后于37℃、5%CO_2孵育箱内培养一段时间后,通过光镜、电镜观察CDDP引起的细胞形态学及超微结构改变,噻唑蓝(MTT)法检测CDDP细胞毒性,荧光法测定氧自由基水平、细胞内脂质过氧化物水平、GSH含量以研究CDDP引起的氧化性损伤,通过琼脂糖凝胶电泳及流式细胞仪技术研究CDDP引起的DNA损伤。同时,又以EMD为干预物用上述方法测定其对CDDP引起细胞氧化性损伤和DNA损伤的预防作用,研究其预防机制。 结果倒置显微镜下观察,发现wi一38细胞经60、120mg·L一,CDDP处理巧 h后,细胞逐渐圆化,胞膜边界清晰,并随CDDP浓度的增加改变愈加明显;30 mg屯一, EMD干预后,细胞质逐渐伸展。经MTT法测定,CDDP作用22h后对W工一38细胞毒 性最大,半数抑制浓度(IC动为16士3 mg·L一,;30mg·L一,EMD干预后,细胞毒 性明显减小,ICS。为34士6mg·L一,。经荧光法测定,CDDP作用不同时间后,细胞 内氧自由基水平明显增加,且在作用3h后,增加最明显,此时GSH含量明显减 少,CDDP作用22h后,细胞内脂质过氧化物水平明显增加;EMD干预后,细 胞内氧自由基、脂质过氧化物增加更加明显,GSH减少也更加明显。透射电镜下 观察发现,CDDP作用22h后,部分细胞表面形成较大的胞质突起,胞质内含有 大大小小的空泡,核内异染色质边集于核膜;EMD干预后,此现象基本消失。经 琼脂糖凝胶电泳测定,CDDP作用22h后,呈现典型180~200 bp整数倍的梯形 条带,并随浓度增加条带愈加明显;EMD干预后,梯形条带几乎消失。经流式细 胞仪检测,发现CDDP使细胞凋亡率明显增加,G。十G:期细胞百分数明显减少,S 期细胞百分数明显增加;EMD干预后,细胞凋亡率明显减少,G。十G。期细胞百分数 增加,S期细胞百分数减少。 结论(1)CDDP可诱导细胞产生氧自由基,耗竭细胞内GSH,脂质过氧化 物生成增加,诱发氧化应激,引起细胞氧化性损伤。(2)CDDP可导致细胞内DNA 损伤,使细胞周期改变,从而诱发细胞凋亡。(3) EMD不仅不能减少CDDP对细 胞的氧化性损伤作用,而且能协同CDDP增强其对细胞的氧化性损伤。(4) EMD 对CDDP细胞毒性的预防作用可能与减少DNA损伤的发生和对细胞周期调节的影 响有关。
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R96

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【参考文献】
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