肾脏毒物致人胚肾293细胞DNA损伤的核苷酸切除修复

【摘要】： 在化学物对肾脏造成的损伤中，DNA损伤被认为是其机制之一。顺铂(顺式二氯二氨铂，Cis-diamminedichloroplatinum，CDDP)是临床最主要的化疗药物之一，但往往因其严重的肾脏毒性限制了其用药剂量。CDDP肾毒性的机制之一是氧化应激，但是氧化性损伤并不能完全解释顺铂诱导的肾毒性。人们在研究中发现顺铂肾毒性另一个重要机理是DNA损伤。顺铂可与DNA能形成链内、链间交联，顺铂肾毒性则与铂(Pt)同DNA形成加合物的水平有关。镉肾脏毒性也与氧化损伤有关，可能是引起细胞毒性的一个重要机制。但也有实验证据表明氧化性损伤并非镉引起肾损伤的直接原因。镉可引起DNA链断裂，形成DNA碱基修饰产物8-羟脱氧鸟苷，损害DNA修复系统，从而造成DNA损伤。马兜铃酸所致肾损伤机制涉及DNA损害、肾小管细胞转分化等。马兜铃酸与DNA形成加合物可能是其肾毒性和致癌性的重要机制。 在DNA损伤的众多修复途径中，核苷酸切除修复(NER)途径能广谱识别大多数严重损伤造成的DNA螺旋扭曲，是DNA损伤的主要修复系统，也是机体抵抗致癌效应的主要防御机制。对大分子加合物来说，只有NER途径具有修复活性。NER的过程涉及特异性损伤的识别，损伤链的双酶切，损伤部位的移去，缺口的填补和最终链的连接。 本研究运用了分子生物学手段利用两步转染法将携带NER基因ERCC_1/XPF的重组质粒转染至人胚肾293细胞，建立了过表达ERCC_1/XPF蛋白的细胞系，以提高293细胞的NER能力。并以此为研究对象观察了上述三种肾毒物对293细胞和过表达ERCC_1/XPF蛋白293细胞的细胞毒作用，以阐明三种肾毒物致活细胞DNA损伤在其各自细胞毒性机制中所处的地位，并评价这种损伤的程度。用NER系统来评价肾脏毒物致活细胞DNA损伤的程度以及阐述肾毒性机制，作者尚未见国内外报道。 方法 本课题利用两步转染法将携带核苷酸切除修复基因ERCC_1和XPF的重组质粒转染至真核细胞人胚肾293细胞。然后用Zeocin和G_(418)筛选获得细胞 克隆，扩增后再通过W七stem七lot检测目的蛋白的表达。采用顺铂对转染前后细 胞形态学和细胞毒作用的影响来评价表达蛋白的生物学功能。 MTT比色法检测顺铂、氯化锡和马兜铃酸染毒1小时对转染前后细胞在24 小时的抑制率，Bliss法计算半数抑制浓度(I C50)。 结果W七stern一blot检测出有目的蛋白的过表达。在相同浓度顺铂作用下， 转染后细胞的受损情况于光镜、电镜和荧光显微镜下观察均有明显减轻。不同 浓度顺铂对转染后细胞·的抑制率明显低于293细胞，表明成功获得了稳定转染 ERCC;/Xl，F的ERCCI/X卫F一293细胞株。 受试物处理细胞1小时，温育24小时后用MTT法检测三种肾毒物对 ERCCI/XPF一293和293细胞的ICS。，结果显示顺铂、氯化锡和马兜铃酸对 ERCC:乃JF一293细胞的IC，。均高于293细胞。顺铂对ERCCI/XPF一293和293细 胞的ICS。分ZfJ为1 .0 11和0.2叫mmo比(P0.05)。氯化锡对ERCCI/xpF一293和 293细胞的ICS。分别为61.91和15.61 p mo比(P0.05)。马兜铃酸对 ERCCI/X卫F一293和293细胞的ICS。分别为321.7和201.9 p mo比(P0.05)。 结论经两步转染成功建立了过表达ERCC;/XPF蛋白的ERCCI/XPF一293 细胞株，过表达的ERCC[次卫F蛋白具有生物学功能，能引起活细胞整体NER 能力的升高。由于NER能力的升高能降低顺铂、氯化锅和马兜铃酸细胞毒细胞 毒性，提示这些肾毒物都能导致活细胞DNA损伤并且所致这种DNA损伤是其 肾毒性的重要机制。在本研究条件下三种肾毒物所致的DNA损伤对活细胞来说 都是一种严重损伤，靠自身的修复系统不易修复，升高的NER系统则能不同程 度的予以修复。

【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R99