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《大连医科大学》 2004年
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高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞间抑制性消减杂交文库的建立和筛选

崔晓楠  
【摘要】:背景:晚近,肿瘤转移机制的研究进入了多基因时代。目前已克隆鉴定的转移相关基因远不能揭示作用在恶性肿瘤转移各个阶段的分子信息,因此高通量筛选肿瘤转移相关基因成为学界瞩目的热点。当前高通量筛选不同生物学表型细胞间差异表达基因的技术主要有表达序列标签(EST)、基因表达系列分析(SAGE)、差异展示(DD-RTPCR)、代表性差异分析(RDA)、抑制性消减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)、以及基因芯片基础上的技术(chip-based approach)等。SSH技术是目前相对成熟的高效筛选差异表达基因的方案,通过抑制性P C R、两轮消减杂交、较高的退火温度(66℃和68℃)和巢式P C R,使得差异表达的c D N A片段得到特异扩增,由于利用了杂交二级动力学原理,实现了高、低丰度序列浓度的均等化,从而使低丰度的差异表达基因也能有效地克隆。Hca-F和Hca-P是一对来自同一小鼠肝癌细胞克隆的不同亚克隆,经615小鼠局部皮下注射后,特异地向引流淋巴结转移,Hca-F为高转移细胞株,转移率>80%,Hca-P为低转移株,转移率<30%。两株细胞为同一亲本,具有基本相同的遗传背景,稳定特异地向淋巴结转移。两者的差异集中于转移表型上,其差异表达的基因片段可能参与肿瘤淋巴道转移的调控。 目的:本实验应用抑制性消减杂交技术研究Hca-F和Hca-P细胞间差异表达之基因,为解析肿瘤淋巴道转移分子机制奠定实验基础。 方法:选用高低转移力小鼠肝癌细胞Hca-F和Hca-P,以使用TRIZOL试剂的一步法分离Hca-F和Hca-P细胞的总RNA,再以结合有Oligo dT的微球作为分离介质,用亲和层析的方法从总RNA中分离mRNA。以所获两种细胞的mRNA为模板,同步逆转录合成cDNA。以Hca—F细胞的cDNA作为Driver,以Hca—P细胞的cDNA作为Tester构建抑制性消减杂交文库。将Tester的cDNA用识别4碱基的限制性内切酶消化后分为均等的两分,分别连接试剂盒提供的不同接头adaptor 1和 adaptor ZR,验证连接效率25%后,别加入过量的Driver eDNA 68OC杂交8小时, 再合并两份杂交产物并加入新鲜变性的过量的Dri ver cDNA 680C杂交16小时。 杂交产物经过LA Taq DNA聚合酶补平末端后,以试剂盒提供的PCR Primerl作 为第一次PCR的引物,以Nested Primerl和Nested Pri!n er ZR作为第二次PCR 的引物,通过抑制性PCR富集大量在Tester中高表达的差异表达基因的cDNA。 然后将PCR产物插入T/A克隆载体,并通过热转化的方法转化大肠杆菌DH一sa。 如此即建立了高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞间抑制性消减杂交文库。以PCR的 方法比较看家基因G3PDH在消减前后的丰度差别进行消减效率的检测,以菌液 PCR的方法检测随机挑选的白色菌落中插入片段的出现频率。用质粒提取试剂盒 提取抑制性消减杂交文库中的重组质粒并进行序列分析。将测序结果进行整理, 选取Nested Primerl和Nested Primer ZR之间的序列,与Genebank Blast 进行同源性比对。 结果:经动物实验证明,实验所用Hca一F和Hca一P细胞具有稳定的淋巴结 转移能力。提取的总RNA纯度较高,吸光度A260/吸光度A280为1.9,经1%琼 脂糖凝胶电泳检测发现提取的RNA有清晰的285和185的条带,且285:1 852: 1,说明RNA没有降解。所获mRNA为分子量大小不等的云雾状阴影,说明提取的 mR入A质优量足。Hea一F和Hea一P细胞的eDNA与Rsal酶切后的Hea一F和Hea一P 细胞的CDNA在1%琼脂糖凝胶上同时电泳,发现酶切后的cDNA片段明显小于酶 切前的cDNA片段,说明酶切较完全。两轮消减杂交后的产物经巢式PcR扩增出 了分子量大小不等的产物,消减后的PCR产物与消减前的PCR产物相比,片段变 小,亮度减弱。以看家基因G3PDH的序列设计引物,用PCR的方法进行消减效率 检测,发现在未消减样品中于PCR反应25循环时即可看见特异性扩增带,而在 消减后样品中于PCR反应35循环才看见特异扩增带,说明经过两轮消减Tester 和Dri ver中都存在的看家基因G3PDH的丰度大幅度下降。对随机挑选的160个 可能含差异表达cDNA片段的白色菌落进行菌液PCR扩增,发现95%的白色菌落 中含有大小不等的插入片段,分子量主要分布在300一70Obp。对提取的重组质粒 进行序列分析和同源性比对发现(公布部分数据),所获的15个序列中8个为已 知基因,分别来自小鼠T”1及T灯:(Telomere哪cat binding Factorl,2,端粒重复 结合因子基因l,2)及maspin;功能尚不明确的胚胎基因mouse 7 days embryo whole body eDNA,砒K卫N full一lengthe丽eh library)elone 221olo2k3,mouse 5 days liver eel 15 eDNA RIKENfull一length library enriehed library,elone E330462F4 及鼠基因组中序列己知功能不详的基因mouse ehromosome 3 elone Rp6一126MI, mouse ehromosome 17 elone RP 26一122M3及mouse ehromosome 4 elone RP13一1 ION10:3个可能来源于新基因;4个片段分别与4个不同的EST序列具有 同源性。 结论:采用抑制性消减杂交技术成功构建了高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞 间抑制性消减杂交文库,为高通量筛选癌淋巴道转移相关基因奠定了坚实的基 础。对文库中所含部分cDNA片段随机序列分析,发现了小鼠TRfl及T盯2 (T
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R735.7

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