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《大连医科大学》 2004年
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白眉蝮蛇去整合素Adinbitor的基因克隆及其生物学活性

王继红  
【摘要】:去整合素(disintegrins)为一组源自于出血性蛇毒的抗粘附蛋白质的总称,因其可强力拮抗整合素(integrin)而得名。其特征为:富含半胱氨酸,并多含有Arg-Gly-Asp (RGD)或Lys-Gly-Asp(KGD)亲水性氨基酸序列,分子量仅为5~9 kD,多为单链蛋白分子。此蛇毒蛋白家族可凭借其RGD分子序列而成为细胞外基质(ECM)与细胞整合素(integrins)间结合的强有力的竞争性拮抗剂;因RGD分子能被血小板纤维蛋白原受体αIIbβ3识别,其还具有抑制ADP诱导的血小板聚集的作用。因此,去整合素可运用于与细胞黏附相关的疾病研究领域,如血管新生、肿瘤转移、血栓症等。关于去整合素的功能研究, 国内外已有的相关报道为:台湾的Rhodostomin[1]和Accutin[2]、韩国的Salmosin[3] [4]和Saxatilin[5]、美国的Contortrostatin[6]等,这些取自于蛇毒的去整合素均具有抑制血管新生与肿瘤转移,抑制血小板聚集等功效[1-9]。 因为去整合素这一蛇毒蛋白家族可凭借其RGD分子序列而抑制ECM与细胞整合素(integrins)间的结合,所以它所涉及的信号转导通路与整合素密切相关。 整合素为一细胞表面受体的异源二聚体家族,是一组跨膜糖蛋白。迄今为止已知有18种不同的α亚基和8种不同的β亚基组成至少24种的异源二聚体[10- 12]。α及β亚基的N末端(胞外端)共同构成配体结合位点。因为大部分细胞整合素都识别RGD氨基酸顺序,而大多数ECM蛋白都含有RGD顺序,所以RGD序列已被公认为是ECM成分与细胞整合素结合的位点[10]。整合素胞内部分较短,但可以通过a辅肌动蛋白(a-actinin)、踝蛋白(talin)和粘着斑蛋白(vinculin)与细胞骨架相连。 在整合素活化和聚集成簇的位点, 蛋白质聚集成粘着斑复合体而与细胞内表面相连。这些复合体是细胞应答周围环境而产生张力的位点,其可以使细胞改变形状并实现复杂的细胞迁移和细胞分裂等过程[10]。 WP=4 研究发现,位于粘着斑与粘着斑支持物上的信号蛋白是与整合素的胞质结构域相连的,它们形成的联结能够刺激胞内的信号级联反应。在这些位点,从外向内的信号传导将调节包括进入细胞周期、细胞凋亡(apoptosis)、基因转录、调节胞内pH值、细胞分化、细胞迁移等在内的不同的细胞活动。通过整合素从细胞内向细胞外传导的信号可通过亲和力的调节而控制细胞的黏附强度,并帮助在组织发展和浸润期间的ECM重塑 [13]。 在与整合素相关联的信号蛋白分子中,关于分子量为125kD的粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的研究最为详尽。FAK与整合素受体相连,在细胞表面信号蛋白聚集成粘着斑复合体的过程中起着关键的作用。 FAK有6个酪氨酸磷酸化位点(Tyr397、407、576、577、681、925) [14]。Tyr397是自身磷酸化位点,与Src家族NRPTKs SH2区高亲和性结合。Src与FAK自身磷酸化位点的作用可导致Tyr407、576、577磷酸化,使体外FAK激酶活性增加到最大限度;与Src相互作用还可引起Tyr925的磷酸化,从而出现Grb2结合位点而使FAK与Ras/MAPK连接[15]。而Tyr681是Src磷酸化的主要位点[16]。因而磷酸化的FAK能结合多个来自外环境的信号通道。 FAK 还通过蛋白激酶C,磷脂酶A2及p53的信号途径来控制细胞周期和阻止细胞发生凋亡[12, 17]。 由此可见,阻断整合素的信号转导通路,将引起一系列细胞生理活动的改变。而蛇源去整合素无疑将会在其中扮演重要角色。鉴于以往关于去整合素的功能及作用机制的相关报道,本论文对产于中国旅顺的白眉蝮蛇去整合素进行了研究。 我们从产于中国旅顺的白眉蝮蛇(Agkistrodon halys brevicaudus stejneger)毒腺中提取总RNA,利用自行设计的引物进行RT-PCR扩增,获得了219bp的白眉蝮蛇去整合素基因。引物设计的依据是,根据NCBI上发表的蛇源去整合素的蛋白质同源序列反推回DNA序列,然后根据这段DNA序列设计两端引物。测序结果显示,其与韩国的蝮蛇去整合素的saxatilin的同源性最高: DNA序列同源性为95.8%,蛋白质序列同源性为91.8%,且蛋白质中含有去整合素的特征模体RGD及12个半胱氨酸。将去整合素基因进行克隆、转化与诱导后,得到了该蛋白的可溶性高效表达。经组氨酸亲和层析纯化,获得了分子量为9kD的均质蛋白,并将其命名为Adinbitor。 利用人富含血小板血浆的测试系统进行的血小板聚集实验结果表明, rAdinbitor可呈剂量依赖性方式抑制ADP诱导的人血小板聚集。其抑制人血小板聚集的IC50为6μmol/L。 关于血管新生的实验结果表明, rAdinbitor能明显抑制由碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)诱导的人脐静脉血管内皮细胞株ECV304的细胞增殖, 其IC50为0.89μmol/L。rAdinbitor对ECV304细胞对纤连蛋 WP=5 白(fibronectin, FN)的黏附、穿过8.0 μm孔径的多聚碳酸盐膜的迁移、透过人工基质膜的浸润及分化均有明显的抑制作用。进一步的细胞凋亡实验证明,rAdinbitor能呈剂量依赖的方式引起ECV304细胞的凋亡,说明rAdinbitor触发了整合素信号转导通路中的细胞凋亡信号。在体内外的血管生成模型上的实验结果显示, rAdinbitor可显著抑制bFGF诱导的于人工基质膜上的管样物生成及鸡胚绒毛尿囊膜(chick chorioallantoic membrane, CAM)的血管生成。上述结果表明,rAdinbitor为血管新生的有效抑制剂。 对C6神经胶质瘤细?
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:Q78

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