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《大连医科大学》 2004年
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中药肝复康治疗大鼠肝纤维化的实验研究

车颖  
【摘要】:背景和目的 肝纤维化特别是肝硬化的发病率和病死率都非常高。因此,发展适用于肝纤维化的抗纤维化方法是非常迫切的,肝纤维化的研究已成了世界医学攻关中的一个热点课题。肝纤维化及肝硬化主要是慢性肝病造成的,故肝纤维化的逆转是一个常见的世界性难题。随着有效的抗纤维化治疗的出现,病理上证实的肝纤维化改善及肝硬化降解的报道逐渐增多,临床上应用的抗肝纤维化西药如秋水仙碱等,多效果不明显,副作用大,目前尚无疗效满意的抗肝纤维化的西药。以往大量实验表明,中药具有保护肝细胞,改善肝功能,抑制肝星状细胞的活化增殖,抑制转化生长因子-β1 (TGF-β1)的分泌及其活性,促进细胞外基质(ECM)的降解等作用,在促进肝纤维化逆转方面显示了其较大的优势,倍受国内外专家、学者关注。本研究采用雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠,皮下注射四氯化碳诱发肝纤维化模型,分别以中药肝复康胶囊(高、中、低三种剂量)、秋水仙碱及肝脾康干预。光镜观察肝小叶结构、肝细胞变性及炎性浸润情况;电镜观察肝细胞超微结构改变;偏振光显微镜观察基质胶原纤维沉积情况及胶原成分分析;血清检测酶学及肝脏功能以评估肝复康疗效。免疫组化检测细胞因子TGF-(1及层粘连蛋白(LN)的表达;RT-PCR测定基质金属蛋白酶(明胶酶-A/MMP-2)和金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)的基因表达来探讨肝复康抗肝纤维化部分可能的机制。同时采用超声组织定征技术对正常及不同程度纤维化大鼠肝脏的背向散射积分进行测定,旨在探讨超声组织定征技术在肝纤维化中的应用价值。 方法 大连医科大学动物中心提供雌性SD大鼠90只,体重100---150克,室温20℃,自然昼夜,自由饮水摄食。利用四氯化碳皮下注射法(10%CCl4,5ml/kg,每周两次,共13周)制备肝纤维化模型,实验动物随机分为7组:正常组、模型组、肝复康高剂量组、中剂量组、低剂量组、秋水仙碱组、肝脾康组。药物治疗从造模60天后开始,正常对照组与上述各组每日经口分别灌服生理盐水、生理盐水、高剂量肝复康(3.125g/kg)、中剂量肝复康(0.3125g/kg)、低剂量肝复康 WP=6 (0.03125g/kg)、秋水仙碱(1mg/kg)、肝脾康(0.55g/kg),药物的剂量根据体表面积的公式进行换算,每千克体重用量为正常成人用量的6.25倍。按10ml/kg体重灌服,治疗时间为60天。在最后一次给药24小时后,经乙醚麻醉内眦采血检测各项指标,并取肝左叶作为检测标本。赖氏法测定血清谷丙转氨酶 (GPT) 及谷草转氨酶(GOT)活性,采用溴甲酚绿比色法和考马斯亮蓝比色法测定血清白蛋白、总蛋白及白球蛋白比,比色法测定血清羟脯氨酸(Hyp)及血清唾液酸(SA),消化法测定肝组织羟脯氨酸,免疫组化方法检测肝组织LN、TGF-(1表达,光镜观察肝小叶结构、肝细胞变性及炎性浸润情况,电镜观察肝细胞超微结构改变,苦味酸-天狼猩红染色在偏振光显微镜观察基质胶原纤维沉积情况及Image-Pro图像分析系统分析Ⅰ、Ⅲ型胶原面积及其比值情况,RT-PCR测定基质金属蛋白酶(MMP-2)和金属蛋白酶抑制剂(TIMP-1)的基因表达。采用HP5500型彩超仪,S4超宽变频相控阵探头,探头频率2—4MHz进行大鼠肝脏的背向散射积分定量分析。 数据以平均值±标准差表示,用SPSS10.0软件进行单因素方差分析、单因素相关分析及成组设计秩和检验(等级资料),以p0.05为显著性检验界限。 结果 一.肝脏组织形态学变化: 1.肉眼观察 正常组大鼠肝脏质地柔软,表面光滑。模型组大鼠肝脏质地坚韧,表面粗糙,颜色晦暗,有些可见颗粒状的小结节。药物治疗组大鼠肝表面较模型组光滑,质地较柔软。 2.光镜观察 正常组大鼠肝小叶结构完整清晰,肝板以中央静脉为中心呈条索状向四周放射状排列,板间有不规则肝窦,仅于汇管区和中央静脉有少许胶原纤维存在。模型组多数正常小叶结构破坏或消失,由汇管区和中央静脉伸出粗大胶原纤维条索分割、包绕肝小叶,肝细胞索排列紊乱,肝细胞浊肿明显,脂肪变性广泛,部分有坏死。纤维隔内有大量单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及成纤维细胞等细胞浸润。与模型组比较,各药物治疗组肝小叶结构破坏明显减轻,肝脏胶原纤维增生亦明显减轻,纤维条索疏松变窄。肝细胞水肿好转,变性情况明显改善,炎细胞浸润减少。其中肝复康高、中剂量组及肝脾康组肝脏结构改善较为明显。 3.电镜观察 正常肝细胞呈多面体,细胞核为圆形或椭圆形,核膜清晰,胞浆内有散布的核蛋白体和有规律分布的内质网,线粒体呈圆形或椭圆形。模型组大鼠肝细胞明显萎缩,细胞核固缩,内质网扩张呈大囊泡,核蛋白体有明显脱落现象,糖原减少甚或消失,线粒体肿胀呈球形,邻近纤维隔的肝细胞表面微绒毛减少或消失,纤维隔多宽大且致密,边缘平直,狄氏间隙明显扩张,内可见多量 WP=7 的胶原纤维及成纤维细胞增生。肝复康治疗组肝细胞及细胞核略有固缩,内质网明显减少,线粒体稍有肿胀,糖原丰富,纤维隔周围肝细胞微绒毛比较丰富并深入到纤维隔中,纤维隔细而不连续,狄氏间隙内仅见少量胶原束。 4.偏振光显微镜下观察Ⅰ、Ⅲ型胶原 肝组织经苦味酸—天狼猩红染色后偏振光镜下观察,在暗视野下Ⅰ型胶原呈桔红色,有较强的双折光,纤维直径越粗,红色越明亮。Ⅲ型胶原呈绿色,沿肝窦呈纤细的网格状分布。正常组大鼠肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原均分布于汇管区的结缔组织
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R285

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