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《大连医科大学》 2005年
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Toll样受体4/核因子-κB信号途径上调内皮细胞氧化低密度脂蛋白受体LOX-1及它们在介导单核内皮细胞黏附中的作用和药物干预研究

王虹艳  
【摘要】:目的:内皮细胞损伤、炎症机制在动脉粥样硬化的发生和发展中起着极为重要作用。氧化修饰的脂蛋白和局部或远距离的感染是慢性炎症反应的两个重要触发因素。业已证明氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)通过作用于内皮细胞氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)参与这一过程。近年研究表明介导先天免疫和炎症反应的受体Toll-样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)参与了动脉粥样硬化的发生发展。TLR4通过活化下游分子核因子-κB (NF-κB)调节靶基因转录。TLR4与LOX-1在动脉粥样硬化斑块内皮细胞上均表达增高,ox-LDL可上调培养的单核细胞TLR4表达,那么TLR4是否调节LOX-1而参与其后介导内皮细胞损伤及炎症过程有待研究。我们应用TLR4特异性激动剂脂多糖(LPS)刺激体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs),观察TLR4/NF-κB信号途径对HUVECs LOX-1表达的调节及它们在介导内皮细胞黏附功能中的作用,从而在受体水平探讨感染与ox-LDL在动脉粥样硬化发生中相互作用的机理,探讨TLR4/NF-κB信号通路在动脉粥样硬化中的作用机制。应用阿托伐他汀和银杏叶提取物GBE50干预TLR4/NF-κB信号途径,以探讨他汀类药物及银杏叶提取物在防治动脉粥样硬化中的作用机制。 方法: 1.应用脂多糖(LPS)(10~1000ng/ml)刺激体外培养的人脐静 脉内皮细胞(HUVECs)24h。采用RT-PCR方法检测TLR4、LOX-1和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、E-选择素(E-selectin)mRNA表达。采用蛋白质印迹分析检测TLR4、LOX-1蛋白表达。流式细胞术检测表达TLR4、LOX-1阳性细胞数量。采用直接计数方法观察单核细胞与内皮细胞黏附率的变化,为了观察LOX-1和黏附分子ICAM-1、E-selectin在介导内皮细胞黏附功能中的作用,黏附实验前,分别应用抗LOX-1、抗ICAM-1、抗E-selectin抗体(10μg/ml)孵育HUVECs 30min。 2 .应用NF-κB 特异性抑制剂(caffeic acid phenethylester ,CAPE)(20μg/ml)预处理HUVECs 30min,然后以LPS(1000ng/ml)刺激HUVECs 24h。采用免疫组化方法观察NF-κB p65核易位情况;采用蛋白质印迹分析检测核蛋白NF-κB p65表达变化。上述方法检测CAPE对LPS诱导的TLR4、LOX-1、黏附分子ICAM-1、E-selectin 表达及介导单核内皮细胞黏附的影响。 3.应用阿托伐他汀(Atorvastatin,ATV)(10μmol/L)和银杏叶提取物GBE50(80μg/ml)预处理HUVECs 30min,然后以LPS(1μg/ml)刺激24h。检测ATV和GBE50对LPS诱导的TLR4、LOX-1、黏附分子ICAM-1、E-selectin 表达、NF-κB p65活化及介导单核内皮细胞黏附的影响。 结果: 1.LPS (10~1000ng/ml)呈剂量依赖性上调HUVECs TLR4、LOX-1和黏附分子ICAM-1、E-selectin mRNA表达。蛋白质印迹分析显示呈剂量依赖性上调HUVECs TLR4、LOX-1 蛋白表达。流式细胞术分析显示LPS (1000ng/ml)使HUVECs 表达TLR4、LOX-1阳性细胞数量增加。LPS (1000ng/ml)增加单核内皮细胞黏附率,抗LOX-1、ICAM-1、E-selectin抗体均部分抑制LPS介导的单核与内皮细胞黏附率的增加。 2.LPS(1000ng/ml)刺激HUVECs 24h,激活NF-κB, NF-κB p65核易位,核蛋白NF-κB p65表达增加,CAPE(20μg/ml)抑制核蛋白NF-κB p65表达增加,抑制LPS诱导的TLR4、LOX-1和黏附分子ICAM-1、E-selectin mRNA表达上调,抑制TLR4、LOX-1蛋白表达上调和单核内皮细胞黏附率的增加。
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:R363

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