收藏本站
《大连医科大学》 2007年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

缺乏D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶对分枝杆菌生长和细胞形态的影响

屈虹  
【摘要】: 结核病是严重危害人类健康的疾病之一,其致病菌是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Tb)。由于耐多药(multi drug resistant, MDR)甚至是广泛耐药(extensive drug resistant, XDR)结核杆菌的出现,许多一线甚至一些二线抗结核药物都无法有效治疗结核病,因此寻找新的抗结核药物已迫在眉睫。分枝杆菌的特殊细胞壁结构,对其生存和繁殖极为重要,其核心结构由肽聚糖、聚阿拉伯半乳糖和分枝菌酸组成。其中聚阿拉伯半乳糖与肽聚糖之间靠L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺双糖衔接分子连接。该双糖衔接分子中的L-鼠李糖是细菌特有的,人体内不存在,可作为理想且安全的新型抗结核药的靶标。dTDP-鼠李糖为鼠李糖残基供体, RmlA-D四种酶参与dTDP-鼠李糖的生物合成过程,其中rmlA基因编码的D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶(RmlA)催化第一步反应,即葡萄糖-1-磷酸和dTTP在RmlA的催化下生成dTDP-葡萄糖。结核分枝杆菌的rmlA-D基因存在于基因组的不同位置,其中rmlA基因单独存在, rmlB和rmlC基因位于一个操纵子内, rmlD基因与编码鼠李糖基转移酶(WbbL)的wbbL基因及manB基因组成一个操纵子。在本课题组以前的工作中,我们研究并证明了rmlB,C,D基因是分枝杆菌生长必需基因,还建立了结核分枝杆菌RmlB-D的酶活性检测方法,这些研究结果为筛选上述酶的抑制剂,从而发现新的抗结核药物提供了基础。 本论文以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Sm) mc2155菌株作为实验模式菌,用同源重组方法建立mc2155 rmlA基因敲除菌株。通过测定rmlA基因敲除菌株的生长曲线,确定rmlA基因是否为分枝杆菌生长必需基因。在此基础上,研究RmlA酶缺乏时rmlA基因敲除菌株细胞形态的改变,和在缺乏RmlA酶的情况下rmlA基因敲除菌株蛋白质谱的变化。研究结果将为参与dTDP-鼠李糖合成的D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶作为研发抗结核新药的靶标提供更有力的证据。 本文获得以下结果: 1.条件性复制质粒pPR27-xylE-Sm rmlA::KanR的构建: 根据Tb RmlA的氨基酸序列,对TIGR的耻垢分枝杆菌mc2155菌株基因组数据库进行BLAST分析,获得mc2155的rmlA和启动子(上游约500 bp)序列。从mc2155基因组中PCR扩增该基因及其启动子序列,克隆到pMD18-T克隆质粒,用BcaBEST Primer M13-47、RV-M对质粒上携带的Sm rmlA基因及其启动子序列进行DNA测序,并与已知的Sm rmlA基因及其启动子序列进行比对,结果表明PCR扩增的是正确的Sm rmlA基因。 用BamHI酶切pUC4K质粒获得Kan抗性基因(KanR) ,用Klenow补平KanR基因的两端并克隆到pMD18-Sm rmlA质粒中Sm rmlA上的StuI位点,产生Sm rmlA::KanR突变基因。再将Sm rmlA::KanR突变基因克隆到pPR27-xylE质粒,构建出条件性复制质粒pPR27-xylE-Sm rmlA::KanR。pPR27-xylE携带温度敏感型复制子,使质粒在允许温度(30°C)条件下可以复制,在非允许温度(42°C)条件下不能复制。pPR27-xylE还携带xylE基因和负选择标记sacB基因。 2.营救质粒pCG76-Tb rmlA的构建: 从结核分枝杆菌H37Rv基因组中PCR扩增Tb rmlA基因,克隆到pMD18-T克隆质粒,测序与比对结果表明PCR扩增的是正确的Tb rmlA基因。用NdeI和XhoI酶切质粒pMD18-Tb rmlA,获得Tb rmlA基因,克隆到pET23b-Phsp60质粒的相应位点,构建出pET23b-Phsp60-Tb rmlA质粒。再经XhoI酶切、Klenow补平和XbaI酶切获得Phsp60-Tb rmlA片段。其中的Phsp60是来源于分枝杆菌BCG热休克蛋白60的启动子。将Phsp60-Tb rmlA克隆到pCG76质粒,构建出pCG76-Tb rmlA营救质粒。由于pCG76不携带用于目的基因表达的启动子,目的基因Tb rmlA的表达由Phsp60启动子所控制。此外,pCG76质粒也携带温度敏感型复制子,使质粒在30°C条件下可以复制,在42°C条件下不能复制。因此,可以通过调节温度使pCG76-Tb rmlA营救质补偿或不补偿mc2155 Sm rmlA基因敲除菌株中Sm rmlA::KanR突变基因的功能。 3.第一次同源重组突变菌株mc~2155 M-1的筛选: 将条件复制性质粒pPR27-xylE-Sm rmlA::KanR电转化到mc2155感受态细胞中,由于pPR27-xylE-Sm rmlA::KanR在42oC不能复制,Sm rmlA::KanR与mc2155基因组中的Sm rmlA发生同源重组,使Sm rmlA::KanR以及sacB基因和xylE基因整合到mc2155基因组中。用Sm rmlA探针对SmaI酶切的7个黄色菌落基因组DNA进行Southern杂交分析,结果显示发生第一次同源重组的mc2155 M-1突变菌株具有预期的杂交条带(3.24 kb,7.72 kb和8.07 kb)。 4.第二次同源重组突变菌株mc2155 M-2 (Sm rmlA基因敲除)的筛选: 将pCG76-Tb rmlA营救质粒电转化到mc2155 M-1感受态细胞中,用含10%蔗糖的选择性LB琼脂培养基,在30°C培养转化的mc2155 M-1,由于条件复制质粒的sacB基因和xylE基因也被整合到mc2155 M-1基因组中,sacB基因的表达产物Levansucrase水解蔗糖,产生有害细菌生长的物质,引起mc2155 M-1死亡,所以在这种选择压力下,mc2155 M-1基因组中的Sm rmlA::KanR与Sm rmlA发生第二次同源重组,将Sm rmlA基因、scaB基因以及xylE基因从mc2155 M-1基因组中删除并被核酸酶水解,基因组中只存在Sm rmlA::KanR。如果Sm rmlA为分枝杆菌生长必需基因,营救质粒上的Tb rmlA基因必须在mc2155 M-2突变菌株中表达出Tb RmlA蛋白质以补偿Sm rmlA::KanR的功能。用Southern印迹方法筛选出mc2155 M-2突变菌株,即Sm rmlA基因敲除菌株。 5.生长曲线的测定 测定mc2155 M-2突变菌株在30°C和42°C的生长曲线,结果发现该突变菌株在30°C可以生长,但在42°C不生长,说明rmlA基因是分枝杆菌生长必需基因。 在随后的温度转换实验中,让mc2155 M-2突变菌株在营救质粒容许的30°C生长20小时,使之表达一定量Tb RmlA蛋白后,提高温度至42°C,使pCG76-Tb rmlA不能复制,影响Tb RmlA蛋白的表达。在Tb RmlA逐渐缺乏的情况下,测定mc2155 M-2突变菌株的生长曲线。结果显示mc2155 M-2突变菌株可以在42°C继续增殖1-2天,第三天以后逐渐有细菌死亡,菌量减少。进一步说明了rmlA基因是分枝杆菌生长必需基因。 6. RmlA缺乏对突变菌株mc2155 M-2细胞形态的影响在温度转换实验中,取mc2155 M-2突变菌株细胞用扫描电镜观察其细胞形态。结果显示在30°C条件下,该mc~2155 M-2突变菌株均呈短棒状、轮廓饱满、表面光滑的形态。与野生型对照无明显差异。但在42°C条件下,营救质粒Tb rmlA表达受影响致使RmlA蛋白缺乏时,第三天菌体表面出现明显的塌陷和皱褶,第六天甚至出现大量破碎样物质,菌体轮廓亦不清晰,似乎都粘连在一起,部分细菌发生裂解。说明RmlA蛋白缺乏对细胞壁完整性有影响,可导致细胞裂解。 7. RmlA缺乏对突变菌株mc~2155 M-2蛋白质谱的影响 在温度转换以后,收获在42°C生长5天的mc2155 M-2细菌细胞提取胞浆蛋白,进行双向凝胶电泳,初步发现mc2155 M-2的蛋白质谱有所变化。与对照相比,rmlA基因敲除以后蛋白质点变少,由于RmlA的缺乏可能导致许多与胞壁代谢有关蛋白的降低,需要进一步确认这些点。 结论: 本研究以耻垢分枝杆菌mc~2155菌株作为实验模式菌证明rmlA基因与分枝杆菌生长的相关性。我们构建了携带Sm rmlA::KanR突变基因的条件复制质粒并转化mc~2155,用Southern印记方法筛选出发生第一次同源重组的mc~2155 M-1突变菌株。又构建了携带Tb rmlA基因的营救质粒pCG76-Tb rmlA,并转化mc~2155 M-1,当Tb rmlA基因表达时, mc~2155 M-1基因组中的Sm rmlA::KanR突变基因与Sm rmlA基因发生第二次同源重组,用Southern印记方法筛选出发生第二次同源重组的mc~2155 M-2突变菌株,即Sm rmlA基因敲除菌株。根据Sm rmlA基因敲除菌株在30°C和42°C条件下的生长曲线,以及在缺乏Tb RmlA蛋白条件下Sm rmlA基因敲除菌株细胞形态的改变和蛋白质谱的变化,我们证实了编码结核分枝杆菌D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶(RmlA)的rmlA基因是分枝杆菌生长所必需的基因。缺乏RmlA蛋白使细菌胞壁成分合成受阻,导致细菌裂解死亡。在缺乏RmlA蛋白时,细菌蛋白质谱也发生了改变。我们将进一步对这些蛋白质进行鉴定,以发现更多的药物作用靶点。 本研究结果为参与dTDP-鼠李糖合成的D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶作为研发抗结核新药的理想靶标提供更有力的证据,以便用D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶促反应筛选酶抑制剂,发现先导化合物。 未来研究方向: 1.重复和优化双向电泳条件,并根据双向电泳结果,对感兴趣的蛋白质差异点用胰蛋白酶进行酶解,然后用质谱方法获得肽质谱并与数据库比对,以发现更多的靶点。然后进一步采用分子生物学的方法,克隆这些差异蛋白的基因,鉴定其功能,以期发现rmlA基因与其它基因之间是否存在相互调控相互影响的关系。 2.用高效液相色谱(HPLC)方法分析Sm rmlA基因敲除菌株与野生型mc2155菌株之间细胞壁聚糖(聚阿拉伯半乳糖)结构的差异;用气相色谱(GC)分析二者糖组成的差别; 3.通过RmlA酶活性检测方法的建立,筛选和优化有该酶抑制活性的先导化合物,以期寻找到新型抗结核药物。在此基础上,用本文构建的rmlA基因敲除细胞模型进一步鉴定该化合物。
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R52;R378

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 胡志东;陈淑丹;罗如松;刘伟;曹健;王洪海;张雪莲;;结核分枝杆菌膜蛋白Rv0849免疫学特性的初步检测[J];郑州大学学报(理学版);2010年03期
2 张磊磊;由鹏飞;姚广新;侯爵;张怡轩;;新型抗结核分枝杆菌药物筛选模型的建立[J];微生物学杂志;2011年01期
3 刘平;;分枝杆菌阿拉伯半乳聚糖生物合成途径研究进展[J];安徽农业科学;2009年17期
4 张文利;马郁芳;;分枝杆菌聚阿拉伯半乳糖的结构和生物合成过程及其应用意义[J];现代生物医学进展;2008年09期
5 王庆忠;张鹭;徐颖;陈嘉臻;祝秉东;郄亚卿;王九龄;王洪海;;结核分枝杆菌Rv2629基因产物的亚细胞定位和穿梭质粒转化耻垢分枝杆菌[J];微生物与感染;2008年02期
6 王和;罗振华;徐艳;梁菁苹;;细胞壁缺陷结核分枝杆菌耐药性的基因研究[J];中国抗生素杂志;2007年10期
7 母连军;;结核病的现行疗法和新药开发进展[J];国外医药(抗生素分册);2007年02期
8 高鹏;肖春玲;姜威;蒋建东;;Ser/Thr蛋白激酶信号转导系统——抗结核药物筛选的新靶点[J];国外医药(抗生素分册);2007年02期
9 张文利;辛毅;马郁芳;;用PCR方法定向突变结核分枝杆菌glmU基因[J];现代生物医学进展;2009年10期
10 董海燕;张建中;万康林;;结核分枝杆菌毒力相关因子研究进展[J];医学研究杂志;2011年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张健;Kay-Hooi Khoo;Delphi Chatterjee;;分枝杆菌细胞壁的生物合成—糖化学生物学的探索[A];2008年全国糖生物学学术会议论文摘要[C];2008年
2 朱明利;;分枝杆菌L型及其检测方法[A];2006年浙江省检验医学学术年会论文汇编[C];2006年
3 朱明利;;分枝杆菌L型及其检测方法研究进展[A];2007年浙江省医学病毒学、医学微生物与免疫学学术年会论文汇编[C];2007年
4 张月新;辛毅;马郁芳;;结核分枝杆菌RmlB的表达、纯化及酶促反应动力学研究[A];2008年全国糖生物学学术会议论文摘要[C];2008年
5 张智慧;陈兴;;蛋白芯片技术检测结核分枝杆菌的临床应用[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年
6 吴园;钟敏;王易伟;钟静;胡频频;毛旭虎;;Rv0341用于诊断依赖利福平结核分枝杆菌结核病的研究概况[A];中国防痨协会临床委员会、中国防痨协会基础委员会学术研讨会论文集[C];2008年
7 陈恬;谢建平;;结核分枝杆菌PE_PGRS蛋白研究[A];重庆微生物学会第九届会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2009年
8 黄海荣;Michael McNeil;;结核分枝杆菌基因Rv3806c以及耻垢分枝杆菌mc2155和棒状分枝杆菌中Rv3806c同源基因的功能分析[A];中华医学会结核病学分会2006年学术会议论文汇编[C];2006年
9 韩喜琴;;噬菌体生物扩增法检测结核分枝杆菌药物敏感性的研究(摘要)[A];中华医学会结核病学分会2004年学术会议论文汇编[C];2004年
10 韩喜琴;高微微;李传友;马玙;;噬菌体生物扩增(PhaB)法、DNA序列分析法及PCR-SSCP检测结核分枝杆菌耐药性的分析及评价[A];2004年中国防痨协会临床基础专业委员会学术会议论文集[C];2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 韩晓玲 通讯员 范敬群 金安江;华中农大研究成果获世界声誉[N];湖北日报;2009年
2 云南 张跃;用89C52制作压电穿刺细胞壁控制器[N];电子报;2008年
3 庞农丰;“粒正”上市备受期待[N];河南科技报;2009年
4 王宝琳;木地板张大口到底谁之过[N];科技日报;2005年
5 香红星;走进微生物世界让这个“小精灵”为你增效[N];中国畜牧兽医报;2006年
6 庄愉;新型抗结核疫苗的开发研究[N];中国医药报;2002年
7 保健时报记者 邱爽;莫因口感“废”蔬菜[N];保健时报;2007年
8 蒲昭和;怎样吃胡萝卜最营养[N];中国医药报;2005年
9 果友;苹果树对钙的吸收和分布[N];陕西科技报;2008年
10 邵明;胡萝卜这样吃[N];大众科技报;2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 屈虹;缺乏D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶对分枝杆菌生长和细胞形态的影响[D];大连医科大学;2007年
2 李威;结核分枝杆菌rmlB和rmlC基因是分枝杆菌生长相关基因[D];大连医科大学;2005年
3 沈国妙;结核病复发及结核分枝杆菌耐药机制的研究[D];复旦大学;2006年
4 董海燕;中国13省市结核分枝杆菌基因多态性分析[D];中国疾病预防控制中心;2011年
5 宋文刚;茜草素抗结核分枝杆菌作用机制的蛋白质组学研究[D];吉林大学;2007年
6 陈嘉臻;结核分枝杆菌特异的RD2/RD11蛋白应用于结核免疫诊断的研究[D];复旦大学;2009年
7 董旭;耻垢分枝杆菌内源性聚阿拉伯糖水解酶的纯化及相关基因的克隆表达[D];大连医科大学;2006年
8 史丽滨;耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)EmbC蛋白C端的功能探讨[D];大连医科大学;2005年
9 张宗德;结核分枝杆菌体内表达基因的筛选研究[D];北京市结核病胸部肿瘤研究所;2007年
10 温占波;分枝杆菌噬菌体D29气溶胶特性和动物气溶胶暴露系统的初步研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 武京国;结核分枝杆菌Rv3627c基因的克隆表达与功能分析[D];大连医科大学;2009年
2 宋宇;结核分枝杆菌MurA的优化表达及功能分析[D];大连医科大学;2010年
3 胡志东;结核分枝杆菌膜蛋白Rv0849功能和免疫学特性的研究[D];河南工业大学;2010年
4 蔡溢;结核分枝杆菌RmlA的表达、纯化以及酶促反应动力学研究[D];大连医科大学;2006年
5 吴悦涵;结核分枝杆菌Rv0901基因在耻垢分枝杆菌的克隆表达及其功能研究[D];四川大学;2004年
6 费良润;结核分枝杆菌葡糖胺-6-磷酸合成酶的克隆表达及其性质研究[D];西南大学;2008年
7 张月新;结核分枝杆菌RmlB的表达、纯化及酶促反应动力学研究[D];大连医科大学;2008年
8 栗莉;结核分枝杆菌dTDP-4-酮基-6-脱氧-L-鼠李糖还原酶(RmlD)的表达及酶活性测定[D];大连医科大学;2006年
9 郝萍;结核分枝杆菌磷酸葡糖胺变位酶在E.coli中的高表达[D];大连医科大学;2008年
10 陈长恒;结核分枝杆菌冷休克蛋白CspA的克隆、表达和性质研究[D];西南大学;2007年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026