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《大连医科大学》 2007年
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岩藻糖基转移酶Ⅳ对A431细胞增殖与凋亡的影响

杨雪松  
【摘要】: 一.目的和意义 许多细胞表面糖蛋白或糖脂是含有岩藻糖(Fucose, Fuc)化的糖链,参与胚胎发育、组织器官形成,并且与肿瘤的生长、浸润有关,如LeY、LeX、sLeX等Lewis系血型抗原分子。其中LeY寡糖是一双岩藻糖的寡糖[Fucα1→2Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1→R],在人类70-90%的上皮癌中高表达,并与肿瘤细胞的生长、浸润和转移有关,被认为是肿瘤相关的抗原。 岩藻糖基转移酶(FUT)是编码一组催化糖复合物糖链岩藻糖化的酶蛋白,催化糖复合物岩藻糖基化一系列反应的最后一步反应可将L-fucose从GDP-fucose转移至相应受体上形成α1,2,α1,3/4和α1,6连接。到前为止,得到确认的岩藻糖基转移酶基因有13种,其中α1,3岩藻糖基转移酶有六种,包括FUT3,FUT4,FUT5,FUT6,FUT7,FUT9。FUT4 (EC.2.4.1.152)主要在白细胞和上皮细胞中表达。FUT4在肿瘤细胞中表达异常,如肠癌、克隆癌、胰腺癌中FUT4明显升高。LeY寡糖的α1,3岩藻糖基化是由FUT4催化完成的。因此,FUT4是LeY寡糖合成的关键酶。 目前,有关FUT4与细胞增殖及凋亡方面的报道甚少。本课题组前期工作表明,LeY寡糖抗原的抗体可抑制细胞的生长,提示FUT4在人上皮癌细胞增殖中发挥作用。 本文旨在通过克隆人FUT4 cDNA、构建其表达载体并将其稳定表达于人表皮癌细胞A431中,观察FUT4基因转染后对A431细胞增殖的变化和对细胞凋亡作用的影响,为进一步探讨肿瘤糖分子病理机制、FUT4对糖抗原合成的调节及FUT4对肿瘤生长凋亡机理的深入研究提供一定理论基础,并为临床治疗LeY阳性表达的肿瘤提供新的思路。 二.方法 1.从人子宫内膜组织中提取总RNA,利用FUT4全长引物经RT-PCR扩增FUT4 cDNA (1218 bp)片段,克隆至pEGFP-N1表达载体上,经转化、抗生素初步筛选、限制性内切酶酶切鉴定和测序获得重组质粒pEGFP-N1-FUT4。 2.利用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N1-FUT4转染至人上皮癌细胞A431细胞中,经G418筛选后RT-PCR、Western blot和流式细胞技术分析鉴定,获得稳定表达细胞株(A431-FUT4)。 3.采用细胞免疫组化方法和流式细胞技术检测LeY的合成。 4.MTT法检测FUT4对A431细胞生长和增殖的影响,利用软琼脂克隆形成实验观察细胞增殖的变化,流式细胞技术分析FUT4稳定表达细胞株的细胞周期变化。 5.Hoechst 33342染色分析和Annexin V/PI流式细胞技术检测FUT4过表达对细胞凋亡的影响。 6.通过对FUT4基因和蛋白的生物信息学分析,确定FUT4的催化功能性位点,构建突变重组质粒(pEGFP-N1-FUT4M),DNA测序加以鉴定。 7.利用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N1-FUTM4转染至A431细胞中,经G418筛选,获得稳定表达突变FUT4的细胞株(A431-FUT4M)。 8.采用DNA Ladder和Annexin V/PI流式细胞技术检测突变FUT4对细胞凋亡的影响。 三.结果 1.利用RT-PCR从人子宫内膜组织总RNA中成功克隆出1218 bp的FUT4 cDNA,重组阳性克隆经酶切和测序鉴定证实目的基因正确插入pEGFP-N1表达载体中,并与载体上的GFP基因处于同一开放阅读框,即pEGFP-N1-FUT4。 2.利用脂质体转染方法,G418筛选获得两个稳定表达外源FUT4的A431细胞株(A431-FUT4-1和A431-FUT4-2)。 3.经RT-PCR、Western blot和流式细胞技术证实外源FUT4基因转染后FUT4表达增加。免疫细胞化学结果表明,FUT4在细胞浆中表达。 4.FUT4转染组细胞LeY合成较转染空载体对照组细胞LeY的合成水平明显增加。 5 . MTT细胞生长曲线实验结果显示,与转染空载体组细胞(A431-vector)比较,A431-FUT4组细胞增殖能力明显增高(p0.05);在软琼脂中的集落形成数显著增加( p0.01 );细胞周期分析中A431-FUT4组细胞S期明显增多(p0.05)。 6.与转染空载体组细胞(A431-vector)比较,A431-FUT4组细胞的细胞凋亡程度下降,Hoechst 33342染色分析A431-FUT4组细胞的细胞凋亡数减少,Annexin V/PI流式细胞技术检测细胞凋亡百分数也出现明显减少(p0.05)。 7.通过对FUT4基因和蛋白的生物信息学分析,确定FUT4突变位点为Tyr104,将其突变为苯丙氨酸,利用定点突变试剂盒获得突变质粒pEGFP-N1-FUT4M,DNA测序正确。 8.利用脂质体转染方法, G418筛选获得两个稳定表达外源突变FUT4的A431细胞株(A431-FUT4M1和A431-FUT4M2)。 9.A431-FUT4M细胞与转染空载体组细胞和过表达细胞相比,凋亡程度明显增加,DNA分析出现特征性凋亡DNA梯状带,Annexin V/PI流式细胞技术检测细胞凋亡百分数明显升高(p0.05)。 四.结论 1.获得稳定表达FUT4的A431细胞株。 2.FUT4在稳定表达的细胞株中表达增高,定位在细胞浆中。 3.FUT4过表达的细胞株促进LeY糖抗原的合成。 4.FUT4过表达能促进肿瘤细胞的生长。 5.FUT4过表达使细胞凋亡程度明显下降。 6.构建突变FUT4的真核表达载体pEGFP-N1-FUT4M,并获得稳定表达细胞株。 7.稳定表达突变FUT4的细胞株具有诱导细胞凋亡增加的作用。
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R73-3

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