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《大连医科大学》 2008年
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稳定表达人淀粉样前体蛋白HEK293细胞系的建立及鉴定

刘靖  
【摘要】: 目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种常见的神经变性性疾病,其最显著的病理学特征是在脑区(皮质,海马)脑细胞外β淀粉样蛋白(amyloidβprotein, Aβ)沉积形成的老年斑,而Aβ的沉积可以引起神经元功能失调导致阿尔茨海默病的发生。近年来研究表明,Aβ是由40-42个氨基酸组成的肽段,由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)经由酶切产生。 当前研究发现,AD患者脑中APP的mRNA和蛋白的表达量较正常人高。APP基因转录后通过不同的剪接形式,产生几种不同的亚型,分别含有695到770个氨基酸,其中APP695主要存在于神经元细胞中。研究发现,某些家族性AD可能与APP基因发生错义突变有关,其突变后,更易使APP裂解产生Aβ。其中研究最多的是瑞典突变,它是发生于670和671位的串联双突变,发生错义突变后正好在Aβ的N末端前增加了一个酶切识别位点,结果导致Aβ产生增加。基于此,本试验拟通过HEK293细胞系建立高表达APP695sw(Swedish mutant APP695,APP695sw)和APP695wt(Wild-type APP695, APP695wt)的细胞模型,希望可以为进一步研究AD的发生、发展以及为探讨APP及Aβ表达的分子机制提供一个好的模型。 方法:分别将质粒APP695sw/peak12,APP695wt/peak12与peak12转化大肠杆菌NovaBlue,以质粒提取试剂盒提取转化质粒。脂质体介导质粒APP695sw/peak12、APP695wt/peak12、peak12转染人胚肾细胞(human embryonic kidney epithelial cell, HEK293),转染48小时后,加入嘌呤霉素进行稳定筛选,获得稳定的具有嘌呤霉素抗性的HEK293细胞系。通过免疫细胞化学检测与鉴定转染后APP695sw,APP695wt的表达情况。 结果:提取质粒后检测其A260/A280比值均小于2.0,大于1.8,浓度和纯度均能满足转染要求。HEK293细胞在含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培养基中生长良好,经过多次传代换液,细胞数量和质量能充分满足试验要求。通过嘌呤霉素敏感试验确定了抑制HEK293细胞生长的最低浓度。用嘌呤霉素稳定筛选16天后,出现细胞克隆株。通过免疫细胞化学显示,稳定筛选后APP695sw的表达高于转染空载体组,而APP695wt的表达与转染空载体组没有差异。 结论:通过脂质体成功将真核表达质粒APP695sw/peak12转染入HEK293细胞;通过免疫细胞化学试验证实转染后HEK293细胞中APP695sw基因的表达量增高。
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:Q78

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