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《大连医科大学》 2008年
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利用SSH对犬小孢子菌在不同诱导底物表达差异基因的研究

张芙蓉  
【摘要】: 目的:犬小孢子菌病是由亲动物性真菌-犬小孢子菌感染人类所致的头皮、头发、光滑皮肤及甲的传染性皮肤病。随着生活水平不断提高人们的生活习惯随之改变,猫狗等宠物与人类的密切接触导致犬小孢子菌病的发病率逐年增加,特别是犬小孢子菌所致脓癣的病例数急剧增加。有关该病的发病机制,近年多数学者明确提出蛋白酶在皮肤癣菌病中具有一定致病作用,然而蛋白酶与脓癣的相关性及在脓癣中发病机制的研究尚无报道。由于脓癣几乎发生于学龄前儿童头皮处,特殊的发病年龄与部位,提醒了本研究的设想,即儿童头皮组织在犬小孢子菌所致脓癣的发病中存在了某种特殊的致病因子,该因子是否就是文献所报道具有致病作用的蛋白酶尚不清楚。因而,本研究设想以儿童头皮组织诱导底物为tester,儿童光滑皮肤组织诱导底物为driver1,成人头皮组织为诱导底物driver2,应用抑制消减杂交技术(SSH)分别比较犬小孢子菌在tester与driver1,tester与driver2培养中表达的差异基因,再与genebank比对,明确该些差异基因的功能,从而探讨犬小孢子菌在脓癣中的发病机制,也为将来犬小孢子菌所致脓癣的防治及新药作用靶位的开发研究做出一些探索。 方法: 1.将犬小孢子菌菌株接种于米饭培养基中,培养2周,分离出孢子。 2.将相同数量的孢子接种于含儿童光滑皮肤组织、儿童头皮组织和成人头皮组织三种底物诱导培养基以及不含皮肤组织的阴性对照培养基中,培养21-28天后收集三种底物诱导培养基中的菌丝团。 3.利用抑制消减杂交技术分别构建在含tester与driver1培养基中培养的犬小孢子菌菌株正反向差异基因文库。 4.利用抑制消减杂交技术分别构建在含tester与driver2培养基中培养的犬小孢子菌菌株正反向差异基因文库。 5.菌液PCR对所构建的4个文库进行初步筛选鉴定。 6.随机挑取上述构建的4个文库中鉴定为阳性的不等碱基数的各5个克隆进行测序分析。 7.利用斑点杂交方法对tester和driver2正向消减文库初步筛选出的部分阳性克隆进行第二轮筛选。 8.对筛选后的阳性克隆再测序,与NCBI上blast比对,进行初步分析。 结果: 1.犬小孢子菌在含儿童光滑皮肤组织、儿童头皮组织和成人头皮组织三种底物诱导培养基中生长良好,形成菌丝团块,阴性对照培养基犬小孢子菌生长不良。 2.构建的tester与driver1的正反向差异基因文库及tester与driver2的正反向差异基因文库中,以消减cDNA为模板的PCR产物大小均集中在250-750bp大小片段。 3.四个库中各随机挑取240个阳性菌落,利用菌液PCR法对重组子进行鉴定表现出单一扩增条带的克隆约占85%,片段大小多集中分布250-750bp之间。 4.20个克隆,有4个克隆未测出,15个克隆在真菌中均为未知基因,在tester与driver1正向差异基因文库筛选出1个克隆与genebank库中红色毛癣菌线粒体细胞色素b和NADH1-5具有高度同源。 5.斑点杂交在tester与driver2正向差异基因文库中筛选出6个阳性基因。GenBank中的BLASTN和BLASTX分析,6个差异EST在真菌中均为未知基因,其中5个与其它物种的基因有较高的同源性(89%以上),1个未找到明显的同源性。 结论: 1.首次在国内外应用SSH成功构建了不同底物蛋白酶诱导培养基犬小孢子菌蛋白酶表达的差异基因文库。 2.筛选出一个与编码红色毛癣菌线粒体细胞色素b和NADH1-5具有高度同源性,证实该克隆属于皮肤癣菌属,为下一步寻找犬小孢子菌蛋白基因奠定基础。
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R756

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