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人脂肪来源干细胞裸鼠皮下移植的实验性研究

石杰  
【摘要】: 目的: 1.分离和培养人脂肪来源干细胞(hADSCs),对hADSCs的干细胞特性进行鉴定。 2.将表达pEGFP-N3的hADSCs进行裸鼠皮下注射移植,观察细胞的存活和转归。 材料和方法: 人脂肪组织取材,酶消化法分离培养hADSCs。观察细胞形态。以成脂和成骨诱导液连续培养hADSCs 3周后,分别进行油红染色和钙盐染色,观察细胞多向分化能力。分别于原代和第3代用流式细胞仪对细胞进行细胞表面分化抗原CD45、CD34、CD133检测,观察细胞不同阶段的表型特征。hADSCs体外培养后,以脂质体法转染pEGFP-N3质粒,经G418筛选,获得高阳性率的细胞。将筛选后的细胞以注射方式植入裸鼠皮下组织中。分别于8周和12周取材,利用活体化学发光和荧光成像系统进行活体荧光观察,组织切片观察,确定hADSCs植入裸鼠皮下后的存活情况与转归。 结果: 1.利用胶原酶消化法,胶原酶/脂肪比3:1、胶原酶浓度1mg/ml、消化时间1h,可以获得大量hADSCs。体外培养的人ADSC细胞为成纤维细胞样。 2.hADSCs在成脂和成骨诱导液作用下,可以分别向脂肪细胞和成骨细胞分化,表现为油红染色和钙盐染色阳性。 3.在新鲜分离的细胞中有大量CD45~+CD34~-细胞( 37.62% )和CD45~-CD34~+细胞( 24.22%);原代细胞中, CD34~+CD45~-细胞占大多数(58.76%),未见CD45~+细胞和CD133~+细胞。培养3代后,CD34~+CD45~-细胞比例降低(30.47%),CD45~+细胞仅见少量,未见CD133~+细胞。 4.pEGFP-N3质粒-脂质体复合物转化脂肪来源干细胞24h后,大量细胞表达绿色荧光蛋白,绿色荧光蛋白阳性细胞率达(13.0±3.5)%。以适宜浓度G418筛选后,绿色荧光蛋白阳性细胞率达(65.0±5.4)%。 5.以注射方式将pEGFP-N3转染后的hADSCs植入裸鼠皮下组织中,8w和12w后,大体标本可见植入区周围分布荧光阳性区;荧光镜下可见皮下组织中分布荧光阳性细胞,对应光镜下皮下组织中未见荧光阳性结构。 结论: 1.脂肪组织中可以分离获得大量可贴壁生长的细胞,其具有多向分化能力,并具有与干细胞相同的表型特点,即CD34~+CD45~-CD133~-。 2.以脂质体法可以将pEGFP-N3质粒转染入hADSCs,G418筛选后阳性率明显提高。 3.hADSCs裸鼠皮下移植后可以向脂肪细胞分化,hADSCs可作为脂肪组织工程的种子细胞。


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