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《大连医科大学》 2009年
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sLeX和LeY寡糖抗原表达及其调控与胚胎着床

刘帅  
【摘要】: 一、目的和意义 胚胎植入是一个复杂的发育过程,是子宫内膜与胚胎在时空上同步协调准备的过程。一方面,胚胎发育成具有侵入能力的胚泡阶段;另一方面,子宫内膜发育到允许胚胎侵入的接受态,只有二者同时发育到此阶段,植入才可发生。 寡糖作为体内重要的信息分子,参与了细胞-细胞间的分子识别,也介导了细胞内的信号传导。在子宫内膜由非接受态向接受态变化过程中,许多细胞表面寡糖呈阶段特异性变化。Lewis寡糖属于细胞表面寡糖,在胚胎着床过程中发挥重要生物学功能。研究表明:着床窗口期的子宫内膜上皮sLeX表达增加,胚胎上表达L-选凝素(L-selectin),二者相互识别结合,参与胚胎着床。着床窗口期,LeY在人和鼠的子宫内膜上皮高表达,鼠的子宫内膜上皮细胞经LeY抗体预处理后,胚胎的着床率下降;同时,子宫内膜基质金属蛋白酶的活性、表达和分泌被明显抑制。 岩藻糖化Lewis寡糖由岩藻糖基转移酶(Fucosylrans-ferase,FUTs)催化合成。目前已发现11种岩藻糖基转移酶( FUT1-11)。根据它们所催化生成的糖苷键类型的不同,可分为α1,2、α1,3和α1,6三类。其中,FUT7属于α1,3岩藻糖基转移酶,是sLeX [NeuAcα2→3Galβ1→4 (Fuc1→3) GlcNAcβ1→R]合成的关键酶。FUT4也属于α1,3岩藻糖基转移酶,催化L-fucose从GDP-fucose转移到H type 2 [Fucα→1Galβ1→4GlcNAcβ1→R]抗原,合成LeY[Fuc1→2Galβ1→4 (Fuc1→3) GlcNAcβ1→R],为LeY寡糖抗原合成关键酶。对FUT7和FUT4表达的调控可以调节细胞表面sLeX及LeY寡糖抗原的表达水平。 本文通过对FUT4和FUT7的调控,进而对细胞表面sLeX、LeY寡糖抗原合成的调节,探讨细胞表面寡糖抗原sLeX、LeY在胚胎着床过程中的功能,进一步探讨其在生殖过程中的作用机制,为阐明寡糖在生殖中的作用提供理论依据。 二、方法 1.利用脂质体转染法将重组质粒转染至人子宫内膜细胞系(RL95-2、HEC-1A),人胚胎细胞系(JAR)中。 2.采用RT-PCR方法检测FUT4,FUT7基因表达。 3.采用Western blot、间接免疫荧光方法和流式细胞技术检测FUT4、FUT7、sLeX和LeY的表达。 4.采用Annexin V/PI流式细胞技术检测细胞凋亡。 5.利用黏附实验观察和分析胚胎细胞与子宫内膜细胞黏附情况。 三、结果 (一)sLeX/L-selectin介导的双向黏附在胚胎着床中的作用 1.通过间接免疫荧光方法检测到JAR/RL95-2细胞同时表达sLeX/L-选择素。 2.抗体封闭实验表明,sLeX和L-选凝素抗体分别封闭JAR细胞和RL95-2细胞,可以抑制JAR细胞与RL95-2细胞的黏附率。表明:JAR细胞和RL95-2细胞表面sLeX、L-selectin都参与胚胎着床。 3.将FUT7过表达质粒分别转染至JAR细胞与RL95-2细胞,可增加细胞表面sLeX寡糖抗原的合成,促进JAR细胞与RL95-2细胞的黏附率;当JAR细胞和RL95-2细胞同时转染FUT7过表达质粒时,黏附率升高最为明显。表明:JAR细胞和RL95-2细胞表面sLeX介导胚胎着床。 4.肝素为L-选凝素的抑制剂,当用肝素分别封闭JAR细胞与RL95-2细胞后,可抑制JAR细胞与RL95-2细胞的黏附率,当JAR细胞与RL95-2细胞同时经肝素封闭后,黏附率抑制作用最为明显。表明:JAR细胞和RL95-2细胞表面L-selectin介导胚胎着床。 5.RL95-2细胞的凋亡较为转染组比较有所增加,转染空载体组与对照组无显著差异。 (二)LeY寡糖抗原与子宫内膜接受潜能的关系 1.JAR细胞与RL95-2细胞的黏附率高于其与HEC-1A细胞的黏附率。 2.应用Western blot和间接免疫荧光方法检测RL95-2细胞LeY表达高于HEC-1A细胞。 3.应用RT-PCT、Western blot和间接免疫荧光方法检测RL95-2细胞FUT4表达高于HEC-1A细胞。 4.FUT4-siRNA抑制RL95-2细胞中FUT 4和LeY表达,可抑制胚胎细胞与子宫内膜细胞的黏附率。 5.FUT4-过表达质粒促进HEC-1A细胞中FUT4和LeY表达,促进胚胎细胞与子宫内膜细胞的黏附率。 6.FUT4-siRNA可以抑制RL95-2细胞中EGFR/MAPK信号通路的激活,FUT4-过表达可以激活HEC-1A细胞中EGFR/MAPK信号通路。 四、结论 (一)sLeX/L-selectin介导的双向黏附在胚胎着床中的作用 1.JAR细胞表面表达L-选凝素,RL95-2细胞表面表达sLeX寡糖抗原,L-选凝素与sLeX寡糖抗原相识别,介导胚胎着床。 2.JAR细胞表面表达的sLeX寡糖抗原与RL95-2细胞表面表达的L-选凝素相识别,介导胚胎着床。提示在胚胎细胞与子宫内膜细胞表面的sLeX和L-selectin介导的双向黏附系统在胚胎着床过程中发挥作用。 3.sLeX介导的细胞黏附引起RL95-2细胞凋亡。说明sLeX和L-selectin介导的细胞黏附可以进一步引起子宫内膜细胞的凋亡,促进胚胎植入。 (二)LeY寡糖抗原与子宫内膜接受潜能的关系 1.RL95-2细胞中FUT4和LeY寡糖抗原表达高于HEC-1A细胞。提示:FUT4和LeY在高接受态的子宫内膜中表达高于其在低接受态子宫内膜。FUT4和LeY寡糖抗原可以作为子宫内膜接受态的标志。 2.上调或抑制细胞中FUT4表达,可以调节细胞表面LeY寡糖抗原的合成,进而影响胚胎与子宫内膜的黏附率。说明LeY寡糖抗原在胚胎植入的过程中发挥作用。 3.FUT4通过调节细胞表面LeY寡糖抗原的合成,进而调控细胞中EGFR/MAPK信号通路的激活,并参与胚胎着床。
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:Q492

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