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《大连医科大学》 2009年
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A20基因对H_2O_2诱导的平滑肌细胞增殖及分子机制探讨和中药大黄素干预研究

李蕾  
【摘要】: 目的:血管平滑肌细胞增殖是动脉粥样硬化(AS)及经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后再狭窄(RS)的重要原因[1],对增殖机制以及抑制其增殖的研究近年来一直是心血管领域的热点。过氧化氢(H2O2)是一种体内氧自由基,属于活性氧家族成员之一。新近的离体研究发现H2O2可以通过细胞内信号传导途径来影响细胞的增殖,分化和多种基因的转录[2]。核因子(NF-κB)是对活性氧敏感的转录因子,对于促炎因子的表达起重要的作用[3]。活性氧通过氧化调节NF-κB使其活化,活化的NF-κB进入细胞核,调节涉及炎症,增殖的多个基因的转录[4]。已有实验证明以H2O2为主要代表的活性氧通过转录因子NF-κB信号通路激活诱导血管平滑肌细胞的增殖从而参与了AS和PCI术后再狭窄的发生发展[5]。多种生长因子、细胞因子、粘附分子等参与其病理生理过程,单纯抑制某种特定的因子并不能完全抑制病灶形成。因此,阻断由H2O2损伤引起的平滑肌细胞增殖、分化、迁移、炎症反应等最终共同的关键靶向转录因子NF-κB信号通路,探求内源性细胞保护措施,成为有效防止血管增生性疾病的研究方向。 锌指蛋白A20是一种泛素调节酶,通过泛素化和去泛素化负反馈调节NF-κB信号系统[6],近年研究表明锌指蛋白A20抑制多种炎性细胞诱导NF-κB激活所引起的血管平滑肌细胞增殖,是非常重要的细胞内源性自我保护蛋白[7]。对于A20抗氧化损伤方面的研究甚少,本研究旨在通过采用锌指蛋白A20基因干扰和转染技术对其表达进行调控,观察其对H2O2诱导的人脐动脉血管平滑肌细胞HUASMc增殖和NF-κB、酪氨酸蛋白激酶Syk、细胞周期蛋白D1 CyclinD1、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21表达及NF-κB下游炎症因子TNF-α的影响,以探讨锌指蛋白A20在氧化还原方面对细胞的保护作用,为血管增生性疾病的防治寻求新的途径。 方法: 1)设计并体外化学合成三条人A20的siRNA序列,通过A20mRNA及蛋白测定筛选出对人A20基因具有较高干扰效率的siRNA序列。将培养的HUASMc随机分为六组:空白组(培养基培养,未给与任何干预);A20siRNA组(转染A20siRNA 24小时); scramble siRNA组(转染阴性对照scramble siRNA 24小时);H2O2组(100μmol/L H2O2持续刺激6小时);A20siRNA+H2O2组(转染A20siRNA 24小时后100μmol/L H2O2持续刺激6小时);scramble siRNA+H2O2组(转染阴性对照scramble siRNA 24小时后100μmol/L H2O2持续刺激6小时)。应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)方法测定细胞增殖活性;流式细胞技术观察血管平滑肌细胞细胞周期的变化;RT-PCR方法观察A20mRNA表达变化;Western-blotting方法观察A20、NF-κB p65、Syk、CyclinD1、P21蛋白含量表达。双抗体夹心ELISA方法检测上清液TNF-α表达水平; 2) pCAGGS-GFP/A20质粒菌保涂Amp抗性的平板后,过夜培养。挑单菌落于3ml Amp抗性的LB培养基中37℃摇床中过夜培养,集菌后,进行小量质粒提取,并使用EcoRⅤ/SmaⅠ进行双酶切鉴定,酶切产物1%琼脂糖凝胶电泳。将鉴定好的质粒菌保进行无内毒素质粒的大量提取,将质粒DNA提取物按适当比例稀释,并测定浓度。将培养的HUASMc随机分为四组:空白组(为空白对照组,不加任何干预因素);H2O2组(在培养基100μmol/L的H2O2作用6小时); A20组(向HUASMc转染含A20基因的质粒后培养24小时);A20+H2O2组(先向HUASMc转染含A20基因的质粒,培养24小时后在培养基中加入100μmol/L的H2O2作用6小时)。应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)方法测定细胞增殖活性;流式细胞技术观察血管平滑肌细胞细胞周期的变化;Western-blotting方法观察NF-κB p65、Syk、CyclinD1、P21蛋白含量表达。双抗体夹心ELISA方法检测培养液TNF-α表达水平; 3)体外培养HUASMc,以H2O2作为刺激因素,以不同浓度大黄素(EMD)作为干预因素,采用MTT比色、BrdU掺入法测定细胞增殖;采用RT-PCR方法检测A20mRNA表达水平;采用蛋白质印迹技术检测A20、NF-κB蛋白表达的变化。 结果: 1)与对照组比较,转染A20siRNA的HUASMc中A20mRNA及蛋白表达水平明显降低,以siRNAc最显著,干扰效率大约55%,MTT结果显示H2O2可诱导HUASMc增殖,H2O2后A20干扰对平滑肌细胞增殖活性有协同作用(P0.05)。流式检测结果表明H2O2组S期、G2/M期构成百分比,增殖指数均较空白组明显增加(P0.05);与H2O2组比较,H2O2+A20干扰后,细胞S期构成比和增殖指数明显升高(P0.05)。H2O2刺激后A20mRNA与A20蛋白、NF-κB p65、Syk、cyclinD蛋白表达增加; P21蛋白表达量降低(P0.05)。A20干扰后使H2O2引起的上述变化趋势更加显著(P0.05)。双抗体夹心ELISA结果示培养的细胞液中A20干扰后增加了H2O2所诱导的NF-κB p65下游的细胞炎症因子TNF-α表达水平(P0.05); 2)将提取的重组真核表达质粒pCAGGS-GFP/A20使用EcoRⅤ/SmaⅠ进行双酶切鉴定,酶切产物1%琼脂糖凝胶电泳,质粒大小及酶切结果正确。转染含A20基因质粒的HUASMc MTT细胞增殖活性降低,阻止细胞由G0/G1期进入S期,有效抑制H2O2刺激的HUASMc增殖。明显抑制H2O2所诱导的NF-κB p65、Syk、CyclinD、TNF-α蛋白表达的增高。显著逆转H2O2引起的P21蛋白含量的下调(P0.05); 3)在10~80μmol·L-1范围内,随EMD浓度加大,MTTOD值及BrdU掺入OD值均逐渐变小,对H2O2诱导的HUASMc增殖具有抑制作用,且呈剂量依赖性。同时可呈剂量依赖性使HUASMc中A20mRNA和蛋白表达增加,NF-κB p65蛋白表达减少(P0.05)。 结论: 1) H2O2可诱导体外培养的HUASMc增殖及炎症反应,激活Syk/NF-κB信号通路,上调Syk、NF-κB p65、CyclinD1的表达,下调P21表达,促进炎症因子TNF-α的产生; 2) A20siRNA干扰可以抑制HUASMc内源性A20mRNA和蛋白表达,具RNAi作用; 3) A20干扰可减弱内源性A20对H2O2/ Syk/ NF-κB p65信号通路的负反馈抑制作用,上调Syk、NF-κB p65、CyclinD1表达,下调P21表达,增加炎症因子TNF-α表达,增强H2O2刺激引起的HUASMc增殖活性及炎症反应; 4) A20基因转染可上调细胞内A20的表达,增强对H2O2/Syk/NF-κB p65信号通路负反馈抑制作用,下调CyclinD1表达,上调P21表达,改善细胞周期蛋白/细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的平衡关系,减少炎症因子TNF-α产生,从而达到抑制氧化应激损伤所引起的VSMC增殖及炎症反应; 5)干预A20可能成为防治动脉粥样硬化的新靶点,上调A20可能成为防治动脉粥样硬化性疾病的新方法; 6) EMD对H2O2诱导的HUASMc增殖具有抑制作用,其机制可能通过增加内源性保护蛋白A20的表达并进一步负反馈抑制了NF-κB的激活。
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R285

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【引证文献】
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