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《大连医科大学》 2009年
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壳寡糖经肠道吸收效率以及与肝癌细胞结合特点和抗肿瘤机制

罗福文  
【摘要】: 背景:甲壳素是昆虫和甲壳类动物的外壳中所含的一种物质,是由乙酰氨基葡萄糖组成的聚糖。甲壳素经脱乙酰基处理得到壳聚糖,再经过进一步降解,形成壳寡糖。壳寡糖的化学名为聚氨基葡萄糖胺。据研究,壳寡糖是目前已知自然界中唯一带正电荷的碱性多糖,也是唯一的动物性膳食纤维素。由于壳寡糖分子量低,水溶性好,生物活性高,人体吸收好,从而克服了甲壳素不溶于水、不易被人体吸收的技术难题。所以壳寡糖成为当今国内外研究、开发的重点领域。研究表明,壳寡糖具有广泛的生物学活性:提高机体免疫力,抗菌抑菌作用,促进钙及其它矿物质的吸收,增殖双歧杆菌、乳酸菌等人体有益菌群,对降血糖、降血脂、降血压、保护肝功能等有辅助治疗作用。此外,壳寡糖具有明显的抗肿瘤作用,其对肝癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌、白血病、肉瘤等都有显著抑制效果,然而壳寡糖抗肿瘤机制十分复杂,是多方面、多层次的过程。 肝癌,是全球最为常见的恶性肿瘤之一。因其恶性度高、病情进展快、治疗难度大、生存期短,一般发病后生存时间仅为6个月,故肝癌有癌中之王之称。并且肝癌是富含血管的肿瘤,极易发生转移。目前,临床上的治疗一般以手术、放疗、化疗为三大支柱,但由于肝癌起病隐匿,发展变化快,患者就诊时往往已进入中晚期,失去了最佳手术时机。大多数化疗药物虽可抑制肿瘤细胞过度增生,但毒副作用大,对正常组织细胞也有很强的杀伤作用。故寻找新的抗肝癌药物迫在眉睫。 本实验组前期致力于壳寡糖吸收分布状况的研究,发现壳寡糖能被小肠吸收入血。为了揭示壳寡糖抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡的机制,本实验组通过使用荧光物质标记壳寡糖来研究其对肿瘤细胞的作用,进而探讨在肿瘤细胞表面是否存在与壳寡糖特异性结合的受体。再通过检测一些与细胞凋亡相关的蛋白以及与肿瘤转移相关的细胞因子进一步探寻壳寡糖抗肿瘤机制。 目的:1、研究壳寡糖在体内的吸收状况以及吸收入血和直接排出的比例。2、通过FITC荧光标记壳寡糖来检测肝癌SMMC-7721细胞表面是否存在与壳寡糖结合的受体。3、检测壳寡糖对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制效果及对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。4、研究壳寡糖能否促进人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡以及对凋亡调控蛋白Bcl-2和Caspase-3的影响。 方法: 1、利用异硫氰酸荧光素FITC标记壳寡糖,并通过聚丙烯酰胺凝胶层析柱(P2凝胶)将游离的FITC除去,再给禁食后的小鼠用FITC标记的壳寡糖灌胃,1小时后取血清和肠溶物,经处理后,通过荧光分光光度计分别检测血清样品和肠内溶物中荧光的强度,进而确定壳寡糖是否被吸收入血,以及入血和直接从肠道排出的比例。 2、将FITC标记的壳寡糖单独作用于人肝癌SMMC-7721细胞,并与先用未标记的壳寡糖作用于肝癌细胞再用标记的壳寡糖作用细胞进行比较,观察壳寡糖与肝癌细胞结合是否有饱和现象进而探索肝癌SMMC-7721细胞表面是否存在与壳寡糖特异性结合的受体。 3、利用MTT法检测不同浓度壳寡糖作用于人肝癌SMMC-7721细胞不同时间后细胞增殖活性;应用免疫细胞化学和Western-blotting检测壳寡糖作用肝癌细胞后VEGF表达量的变化。 4、镜下观察不同浓度壳寡糖作用肝癌细胞后发生的形态学变化,并利用荧光Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡状况,通过免疫细胞化学方法研究壳寡糖对肝癌细胞SMMC-7721中Bcl-2和Caspase-3表达的影响。 结果: 1、FITC能够标记壳寡糖,并且利用P2聚丙烯酰胺凝胶层析柱可以很好的分离出游离的FITC;用标记的壳寡糖给小鼠灌胃,从血清和肠溶物中都检测到荧光强度,两者比值为2:1。 2、单独使用标记的壳寡糖作用肝癌细胞在荧光显微镜下观察所有细胞均发出很强的荧光,而先用未标记的壳寡糖作用肝癌细胞再用标记的壳寡糖作用后荧光强度明显减弱。 3、壳寡糖对SMMC-7721细胞增殖有明显的抑制作用,呈剂量依赖关系,并且壳寡糖能明显降低SMMC-7721细胞中VEGF的表达。 4、壳寡糖能促进SMMC-7721细胞凋亡,并能上调促凋亡蛋白Caspase-3的表达和降低抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达。 结论: 1、壳寡糖能通过小肠被人体吸收,吸收入血的壳寡糖与直接排出的壳寡糖的比例为2:1。 2、壳寡糖能与肝癌细胞结合并呈现出饱和性,此现象说明在肝癌细胞表面有可能存在壳寡糖的特异性受体。 3、壳寡糖对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖有抑制作用,此作用可能是通过抑制VEGF的表达来实现的。 4、壳寡糖能促进人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡,此作用可能是通过促进Caspase-3的表达和抑制Bcl-2的表达来实现的。
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R735.7

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