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《大连医科大学》 2010年
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携带p53基因和Flt3L配体基因的腺病毒载体的构建及鉴定

宋默  
【摘要】: 目的:以MUC1为启动子构建携带p53/F1t3L融合基因的腺病毒载体,表达p53基因和Flt3L基因,发挥p53抑癌作用和树突状细胞的免疫治疗、诱导乳腺癌细胞的凋亡的作用,为进一步探讨重组腺病毒载体对乳腺癌的治疗作用提供条件。 方法:通过人工合成MUC1启动子、p53基因和Flt3L配体基因,并在序列两端加入相应的酶切位点,通过酶切、连接等方法将其分别克隆至pUC19载体中,合成pUC19-MUC1、pUC19-p53和pUC19-Flt3L,将反应液全量转化至感受态细胞并进行质粒DNA提取,经DNA序列测定证实目的基因合成正确。利用相应的限制性内切酶将上述三个质粒进行重组,合成并提取质粒pUC19-MUC1-p53和pUC19-MUC1-Flt3L.通过PCR扩增p53基因和Flt3L配体基因,应用linker序列将两个基因连在一起构成融合基因,亚克隆至pUC19-MUC1质粒中,经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收目的片段,对pUC19一MUC1-p53-linker-Flt3L进行测序分析。利用多克隆位点,应用限制性内切酶进行双酶切,回收目的DNA片段并进行磷酸化及末端补平,将目的基因分别插入到在被线性化的pAxcwit2腺病毒载体中,构建成pAx-MUC 1一p53.pAx-MUC 1一Flt3L. pAx-MUC 1一p53一linker-Flt3L,对三个重组质粒进行DNA测序分析及酶切鉴定,证实插入的外源基因与已知gene bank上相应的基因序列一致,构建应用MUC1作为启动子携带p53/Flt3L融合基因的腺病毒载体成功。 结果:人工合成的MUC1启动子、p53基因和Flt3L配体基因序列经DNA序列测定证实与已知gene bank给出的基因序列完全一致,重组质粒pAx-MUC 1-p53.pAx-MUC 1-Flt3L.pAx-MUC1-p53-linker-Flt3L经DNA序列测序、酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果表明重组腺病毒载体中外源基因序列与已知序列一致,15%琼脂糖凝胶电泳释放条带长度与已知基因片段长度一致,证实合成基因正确,构建腺病毒载体成功。 结论: 1.通过基因合成技术成功合成MUC1启动子、p53基因和Flt3L配体基因,与gene bank已知序列完全一致,为基因重组创造了必要的条件。 2.成功构建应用MUC1作为启动子的腺病毒载体,采用MUC1作为启动子,进一步增强后期实验腺病毒载体对于乳腺癌细胞的靶向性治疗。 3.成功构建了应用MUC1作为启动子携带p53/Flt3L融合基因的腺病毒载体。
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R737.9

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【参考文献】
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