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《大连医科大学》 2010年
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缬沙坦和氟伐他汀对糖尿病肾病肾脏保护机制的研究

白然  
【摘要】: 背景: 糖尿病肾病(DN)是糖尿病重要的微血管并发症,也是糖尿病死亡和致残的主要原因之一,其主要病理特征是肾小球硬化和肾间质纤维化。DN的发病机制尚未完全阐明,目前认为是由多种因素协同作用的结果,包括高血糖导致代谢异常、血流动力学改变、多种细胞因子作用和遗传因素等,而细胞因子如转化生长因子β1(TGF-β1)在DN的发生发展中起着非常重要的作用,这些细胞因子在高血糖作用下通过某些信号转导通路促使肾小球硬化和肾间质纤维化的发生和发展。对DN的治疗目前仍是以降糖、降压、调脂等为主的综合治疗方案。其中,血管紧张素受体1拮抗剂(ARB)和羟甲基戊二酰辅酶A(HMG—CoA)还原酶抑制剂(他汀类药物)分别在降压和调脂方面发挥重要作用。 缬沙坦是具有高度选择性的ARB,通过直接作用于血管紧张素受体1降低血压而起到肾脏保护作用;氟伐他汀能有效降低细胞内胆固醇的合成,可通过调节血脂防治肾动脉硬化保护肾脏。目前有很多研究表明,这两类药物同时还有抗细胞增殖、抗炎症、免疫调节等非依赖降压和调脂的肾脏保护作用,但其具体机制尚未完全明了。 有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是细胞将信号从细胞膜传递到核的主要通路,它是细胞促增殖和传递应激信号的关键激酶,参与了细胞的生长、分化、凋亡、应激反应及细胞周期的多种过程。其中p38MAPK主要被多种细胞因子和生理应激所激活,又称为MAPK应激信号通路,近年研究发现p38MAPK是糖尿病多种致病因素的共同信号通路的交汇点,并参与了肾脏纤维化的发生和发展。关于肾纤维化的发生机制目前尚不十分清楚,认为可能与转化生长因子β1(TGFβ1)、血管紧张素Ⅱ(ATⅡ)、肾脏固有细胞表型转化以及肾小管上皮细胞凋亡等有关。其中TGFβ1在肾脏中含量最多,它是一种强致纤维化因子,通过合成细胞外基质(ECM),并刺激肾系膜细胞分泌ECM而促进纤维化的形成。研究发现,TGF-β1与p38MAPK存在明显的相互作用,一方面,TGF-β1通过增强p38MAPK的活性发挥其生物作用,另一方面,p38MAPK通过促进TGF-β1的生成而影响DN进程,二者是导致肾脏纤维化中的重要因素,但TGF-p受体后信号转导途径所知较少。有研究提示p38MAPK可能是TGF-β1系统下游的一个通路,介导TGF-β1导致肾小球硬化。而目前关于缬沙坦和氟伐他汀非依赖降压和调脂的肾脏保护机制研究主要为其他信号通路或单药研究,确切机制尚未阐明,有关这两种药物是否通过影响TGF-β1以及p38MAPK信号通路起到肾脏保护的研究不多。 本实验通过研究缬沙坦和氟伐他汀对体外高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)作用后细胞形态学改变、细胞增殖能力、氧化应激水平以及p38MAPK、TGF-β1表达的变化,进而从临床角度观察应用缬沙坦对早期DN患者血清中TGF-β1水平的影响,探讨这两种药物对DN的治疗是否与p38MAPK通路调节相关及其与TGF-β1的关系,进而阐明其肾脏保护作用的机制,同时评估两种药物单独和联合应用对DN肾脏保护作用的比较,为临床防治DN的有效手段提供理论和实验依据。 方法: 一、HBZY-1细胞的培养和分组 HBZY-1细胞常规培养于37℃,5%CO2的恒温孵育箱中,培养液为含10%胎牛血清的DMEM,取第3~5代用于实验,选择对数生长期的HBZY-1收集,并分成正常对照组(N组,5.5mmol/L葡萄糖)、高糖组(H组,30mmol/L葡萄糖)、甘露醇对照组(M组,5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇)、高糖+缬沙坦组(V组,30mmol/L葡萄糖+终浓度10μmol/L缬沙坦)、高糖+氟伐他汀组(F组,30mmol/L葡萄糖+终浓度10μmol/L氟伐他汀)、高糖+缬沙坦+氟伐他汀组(VF组,30mmol/L葡萄糖+终浓度均为10μmol/L的缬沙坦和氟伐他汀)、高糖+p38MAPK通路阻断剂SB203580组(B组,30mmol/L葡萄糖+20μmol/L SB203580),共7组。 二、细胞形态学观察和氧化应激指标的检测 培养24小时后倒置显微镜下观察各组细胞学形态,四甲基偶氮唑蓝法(MTT)法测定细胞存活率和细胞抑制率。生化法分别测定各组细胞培养上清液中超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA)的含量。 三、p38MAPK、TGFβ1 mRNA的测定 培养24小时后,收集各组细胞,加入Trizol试剂提取细胞总RNA。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定p38MAPK、TGF-β1mRNA水平表达情况。 四、p38MAPK、TGFβ1蛋白的测定 培养24小时后,收集各组细胞,提取细胞总蛋白。Western blot方法、免疫细胞化学法、免疫荧光方法检测各组细胞中p38MAPK、TGFβ1蛋白表达水平和分布情况。 五、早期糖尿病肾病患者血清TGFβ1水平的检测 纳选66例Ⅰ期~Ⅲ期DN患者,根据24h尿微量白蛋白/肌酐(UMA/Cre)将其分为正常白蛋白尿1组(NA1组,UMA/Cre10μg/mg)、正常白蛋白尿2组(NA2组,UMA/Cre10~30μg/mg)、微量白蛋白尿组(MA组,UMA/Cre30-300μg/mg),同时设正常对照组(NC组),各DN组又分为应用和未用缬沙坦组。所有病例清晨空腹抽取肘正中静脉血5m1,分离血清,采用双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA),用荧光免疫分析仪检测每孔在λ=450nm处吸收度计算血清TGF-β1水平。 结果: 一、各组HBZY-1细胞形态变化 0小时,各组细胞形态无差异,24小时,N组的细胞形态正常,结构清晰可辨。M组与N组细胞形态相似,细胞数量均略增多,胞体略肥大。V. F、VF及B组细胞形态改变相似,细胞间隙变大,细胞结构不甚清晰,细胞扁平。H组细胞杂乱无章,扁平程度最明显。48小时,H组已全部脱离瓶壁悬浮于培养上清中。 二、各组HBZY-1细胞的增殖效应 与N组相比,H组OD值明显增加,细胞存活率提高(P均0.05),V、F、VF、B组与H组相比OD值明显减低,细胞存活率减少,细胞抑制率增高(P均0.05),以VF组变化最明显(P0.05)。 三、各组HBZY-1细胞的氧化应激指标 与N组相比,H组细胞上清中SOD和NO活性显著下降,MDA含量明显升高(P均0.05),V、F、VF、B组与H组相比SOD和NO活性升高,MDA含量下降(P均0.05),以VF组变化更明显(P0.05)。 四、各组HBZY-1细胞p38MAPK和TGFβ1 mRNA的表达 与N组相比,H组p38MAPK、TGFβ1 mRNA表达增加(P均0.05),V、F、B组与H组相比p38MAPK、TGFβ1 mRNA表达均减少(P均0.05)。 五、各组HBZY-1细胞p38MAPK和TGFβ1蛋白的表达 与N组相比,H组p38MAPK、TGFβ1蛋白表达增加(P均0.05),V、F、VF、B组与H组相比TGFβ1蛋白表达均减少(P均0.05),VF组表达最少(P0.05)。 六、早期糖尿病肾病患者血清TGFβ1水平 与NC组相比,NA 1组、NA2组、MA组血清TGF-β1水平依次升高,各组间比较差别均有统计学意义(P均0.05),即MA组较NA 1组、NA2组明显升高(P0.05);NA2组较NAl组升高(P0.05)。 七、缬沙坦对早期糖尿病肾病患者血清TGFβ1水平的影响 NA1组中用缬沙坦组血清TGF-β1水平较NA1组未用缬沙坦组明显下降(P0.05);但NA2组和MA组未见到缬沙坦对血清TGF-β1水平的降低作用(P0.05)。 结论: 一高糖在一定时段内有刺激HBZY-1增殖的效应且此效应与渗透压无关,沙坦和氟伐他汀可减弱高糖所导致的细胞增殖,并通过抗氧化应激保护肾小球系膜细胞。 二、缬沙坦和氟伐他汀对糖尿病肾病的肾脏保护可能是通过p38MAPK通路,部分下调TGF-β1的表达来实现的。 三、缬沙坦和氟伐他汀两种药物联合应用对糖尿病肾病的肾脏保护作用优于单独应用。 四、血清TGF-β1水平升高与早期糖尿病肾病患者尿微量白蛋白量呈正相关。 五、血清TGF-βl可作为早期糖尿病肾病的诊断指标之一。
【学位授予单位】:大连医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R587.2

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