枸杞多糖对糖尿病大鼠血—视网膜屏障的保护作用及ROCK通路表达的机理研究

【摘要】：目的：明确枸杞多糖(LBP)对糖尿病大鼠血—视网膜屏障的保护作用,进一步探讨枸杞多糖通过调控ROCK信号通路及其底物P-MLC的表达,减少血—视网膜屏障渗漏的作用机制。 材料与方法：实验一.取健康雄性SD大鼠60只,随机分为3组：CON组：正常对照组；DM组：STZ造模；LBP组：STZ造模成模后予以LBP(250mg/Kg·d)灌胃,DM组予以等量的生理盐水灌胃。分别于4w、8w、12w抽取静脉血,并取眼球。观察大鼠的一般情况；记录各时间点各组大鼠体重变化、血糖值及甘油三酯和胆固醇的浓度；伊文思蓝(EB)45 mg/kg尾静脉注入,分别检测视网膜中EB含量。实验二.健康成年雄性(SD)大鼠54只,分组及给药方法取材时间同实验一,采用HE染色光镜观察各组大鼠视网膜各层组织细胞数量及形态变化。血管铺片形态学观察：视网膜动静脉的形态、管径,同时采取免疫组化方法,检测视网膜血管网VEGF的表达及灰度值半定量分析,采用透射电镜技术观察视网膜毛细血管内皮细胞、周细胞及感光细胞超微结构。实验三.健康成年雄性(SD)大鼠44只,随机分为5组,CON组、DM组、LBP组给药方法取材时间同实验一,F组：成模后法舒地尔(Fasudil)腹腔注射(15mg/kg),L+F组：成模后LBP灌胃+Fasudil腹腔注射,各组于8w取材。分别用免疫组织化学方法检测Occludin、ROCK1表达情况进行半定量分析。免疫印迹方法检测Occludin、ROCK及其底物P-MLC蛋白表达的量,并利用凝胶成像系统对其进行定量分析。实验四.实验细胞RF/6A,MEM培养基继续培养48h,按照1：2-1：4进行传代。分组检测：共分5组,正常对照组：含葡萄糖5.5mmol/L;高糖1组：含葡萄糖30mmol/L；高糖2组：含葡萄糖40mmol/L;LBP+高糖1组：含葡萄糖30mmol/L+LBP(1g/L)；LBP+高糖2组：含葡萄糖40mmol/L+LBP(1g/L)；于1d、3d、5d、7d进行指标检测。倒置显微镜下观察细胞形态的变化；以辣根过氧化酶(HRP)作示踪剂用二室弥散系统检测RF/6A单层通透性,免疫荧光法观察细胞骨架的变化、Western blot检测ROCK1、Occludin和P-MLC的蛋白表达量,并进行半定量分析。 结果： 1.LBP对DM大鼠血糖、血脂及血—视网膜屏障渗漏的影响： (1)血糖变化：LBP干预后的各组大鼠对应同时期的DM大鼠的血糖均有明显下降,4w时血糖下降幅度为57%,8w时下降幅度为40%,12w血糖下降幅度为36%,其降血糖效果以4w最为明显,随着病情的进展LBP的降糖效果有所减弱,下降率基本稳定在35%～40%之间。 (2)体重的变化：DM组成模后,开始出现消瘦,体重下降或增加缓慢,明显低于相同时间段的其他两组大鼠的体重。而LBP组则体重与正常对照组比较略有下降,明显好于DM组。 (3)血脂的变化：DM组12w时甘油三酯基本达到正常值的3倍,而LBP组12w时甘油三酯的浓度有轻度上升。12w时DM组总胆固醇浓度是正常对照组的1.4倍；而LBP组胆固醇浓度与正常组基本无差异p0.05。 (4)EB在血—视网膜屏障渗漏的变化：DM组大鼠EB渗漏量4w、8 w、12 w分别增加了2.1倍、2.3倍、2.7倍。而枸杞多糖组较糖尿病组以上三个时间点EB渗透量降低了50%、40%、27%,组间比较p0.01。前4w保护作用表现就的最明显。 2.LBP对DM大鼠血—视网膜屏障形态学变化的影响： (1)HE染色光镜观察： 12wDM组神经纤维层断裂明显；节细胞、内颗粒层细胞排列明显紊乱；毛细血管明显扩张,数量增加。4wLBP组、8wLBP组各层组织形态与正常组织基本无明显差别,12wLBP组仅出现内、外颗粒层排列稍有不规则,毛细血管的轻度扩张。 (2)视网膜血管铺片：12w DM组毛细血管网迂曲,扭结,某些部位出现节段性膨大,管腔狭窄甚至闭塞。周细胞和内皮细胞有所减少；12wCON DM、LBP组VEGF灰度值216.13±2.71、105.30±4.25、176.72±4.31。组间有明显差异p0.05,DM组并随着病程的进展,VEGF表达的量不断增高。 (3)电镜下超微结构的改变：12w DM组大鼠视网膜基底膜进一步增厚,血管内皮细胞及周细胞肿胀,胞质内线粒体肿胀变性,管腔可出现扩张。视杆细胞膜盘模糊,出现溶解、断裂,间隙进一步扩大。12w LBP胞质内部分线粒体轻度肿胀变性,基底膜增厚不明显,毛细血管壁完整,管腔无扩张。视杆细胞,膜盘结构略有些模糊,结构开始出现紊乱,但纹理尚清。 3.枸杞多糖对糖尿病大鼠血—视网膜屏障保护作用机理的研究： (1)免疫组化法检测的Occludin表达：主要分布在视网膜内五层上。灰度值12w时,CON组143.70±2.29；DM组173.18±3.78；LBP组153.02±3.59,DM组表达较正常对照组显著减少。随着糖尿病视网膜病变时间的延长而逐渐下降。8w各治疗组与DM组比较,Occludin表达量明显增加。F+L组效果最好(p0.05),LBP与Fasudil组之间无明显差异(p0.01) (2)免疫组化法检测的ROCK1表达：主要分布在神经节细胞层和内颗粒层,灰度值12w时,CON组178.32±5.92；DM组155.91±2.76；LBP组178.82±4.33,DM组从4w开始减弱,并随着病程的延长,ROCK1表达的量逐渐增加,而LBP组ROCK表达量并没有明显的增加。各治疗组间比较,F+L组与正常组无明显差异(p0.05),治疗效果最好,Fasudil组的作用要比LBP的效果明显一些(p0.05)。 (3)免疫印迹法检测Occludin蛋白表达：DM组随着病程的延长,Occludin蛋白的量逐渐下降,组间有明显差异p0.01,而LBP组3.57±0.58；F组3.65±0.71；F+L组4.48±0.53,LBP组与F组比较LBP组表达略低,但无明显统计学意义P0.05。F+L组表达量高于其他两治疗组p0.01,与CON组相接近。 (4)免疫印迹法检测ROCK1蛋白表达：各组DM组大鼠ROCK蛋白表达随着病程的延长量逐渐上升,组间有明显差异p0.01；而LBP组3.14±0.51；F组3.05±0.42；F+L组2.62±0.51,LBP组与F组比较LBP组表达略高,有统计学意义p0.05。F+L组表达量高于其他两治疗组p0.01,与CON组相接近。 (5)免疫印迹法检测P-MLC蛋白表达：各组DM组大鼠ROCK蛋白表达随着病程的延长量逐渐上升,组间有明显差异p0.01,而LBP组2.97±0.42；F组2.78±0.53；F+L组2.44±0.47,LBP组与F组比较LBP组表达略高,有统计学意义p0.05。F+L组表达量高于其他两治疗组p0.01,与CON组相接近。 4.枸杞多糖对高糖培养下视网膜血管皮细胞Rho/ROCK信号传导通路的影响：(1)正常RF/6A呈单层扁平上皮状,高糖2组7d组内皮细胞收缩明显,有的伸出长长的伪足,边界模糊,细胞间形成明显的裂隙,细胞生长数量明显较对照组少。高糖1组则于5d后形态开始出现变化。而LBP+高糖1组、LBP+高糖2组,仅于7d时,细胞略有些变圆,细胞数量略少。 (2)RF/6As单层通透性的变化：3、5、7 d高糖组HRP的光密度值明显高于正常对照组(p0.01),尤其高糖2组渗漏更加明显。而LBP则能逆转这种因高糖造成的渗漏(p0.01)。尤以LBP+高糖1组效果较理想,与对应的高糖1组通透性明显降低(p0.01)(3) F-actin形态及分布的变化：对照组F-actin分布均匀,呈网状有序排列,细胞相互融合,连接紧密。高糖2组7d外周致密带明显断裂,胞质内应力纤维断裂,细胞周边出现“绒毛状”短的指状突起,“空洞状”裂隙增大,细胞近似脱落状态。LBP+高糖2组7d外周致密带进一步变细,并且部分出现断裂,细胞间开始出现裂隙,但细胞形态明显好于高糖7d组。(4)ROCK1蛋白表达量：随葡萄糖浓度的增加而升高,与β-actin的光密度比值,正常组0.54±0.25、高糖1组0.85±0.31、高糖2组1.321±0.38,高糖1组和高糖2组与对照组比较p0.01,而这种增高趋势能被LBP所逆转,在葡萄糖浓度为30mmol/L的条件下LBP抑制ROCK1表达的作用更明显。(5)P-MLC蛋白表达量：表达量随葡萄糖浓度的增加而升高,与β-actin的光密度比值,正常组1.34±0.25、高糖1组2.45±0.31、高糖2组3.32±0.38,高糖1组和高糖2组与对照组比较p0.01,LBP抑制P-MLC表达的升高,LBP+高糖1组1.38±0.27,LBP+高糖2组1.87±0.51。(6) Occludin蛋白表达量：随着葡萄糖浓度的增加Occludin蛋白表达量逐渐下降,LBP—高糖1组0.90±0.16,LBP—高糖2组0.69±0.14,各治疗组均可明显提升其相对应高糖组Occludin表达的量,有明显统计学意义p0.01,尤其LBP-高糖1组可明显抑制Occludin表达的量的下降。 结论： 1.LBP可以显著减低糖尿病大鼠的血糖、血脂并能降低血-视网膜屏障的渗漏。 2.LBP可以减低糖尿病大鼠的视网膜血管上VEGF的表达,并能减轻血管内皮细胞和周细胞的水肿,减少基底膜的增厚,并减轻视细胞的损害。3.DR的过程中确实存在着ROCK通路的激活,ROCK及其底物P-MLC表达的上调而该过程可以被LBP所阻断,减低以上信号分子的表达,通过稳定Occludin的表达,起到保护血-视网膜屏障的作用。4.LBP可以明显减轻体外高糖环境培养下的单层EC的渗漏,通过抑制ROCK及其底物P-MLC该信号通路,而起到稳定细胞骨架,维持紧密连接的作用。