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《辽宁中医药大学》 2010年
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枸杞多糖对糖尿病大鼠血—视网膜屏障的保护作用及ROCK通路表达的机理研究

王继红  
【摘要】:目的:明确枸杞多糖(LBP)对糖尿病大鼠血—视网膜屏障的保护作用,进一步探讨枸杞多糖通过调控ROCK信号通路及其底物P-MLC的表达,减少血—视网膜屏障渗漏的作用机制。 材料与方法:实验一.取健康雄性SD大鼠60只,随机分为3组:CON组:正常对照组;DM组:STZ造模;LBP组:STZ造模成模后予以LBP(250mg/Kg·d)灌胃,DM组予以等量的生理盐水灌胃。分别于4w、8w、12w抽取静脉血,并取眼球。观察大鼠的一般情况;记录各时间点各组大鼠体重变化、血糖值及甘油三酯和胆固醇的浓度;伊文思蓝(EB)45 mg/kg尾静脉注入,分别检测视网膜中EB含量。实验二.健康成年雄性(SD)大鼠54只,分组及给药方法取材时间同实验一,采用HE染色光镜观察各组大鼠视网膜各层组织细胞数量及形态变化。血管铺片形态学观察:视网膜动静脉的形态、管径,同时采取免疫组化方法,检测视网膜血管网VEGF的表达及灰度值半定量分析,采用透射电镜技术观察视网膜毛细血管内皮细胞、周细胞及感光细胞超微结构。实验三.健康成年雄性(SD)大鼠44只,随机分为5组,CON组、DM组、LBP组给药方法取材时间同实验一,F组:成模后法舒地尔(Fasudil)腹腔注射(15mg/kg),L+F组:成模后LBP灌胃+Fasudil腹腔注射,各组于8w取材。分别用免疫组织化学方法检测Occludin、ROCK1表达情况进行半定量分析。免疫印迹方法检测Occludin、ROCK及其底物P-MLC蛋白表达的量,并利用凝胶成像系统对其进行定量分析。实验四.实验细胞RF/6A,MEM培养基继续培养48h,按照1:2-1:4进行传代。分组检测:共分5组,正常对照组:含葡萄糖5.5mmol/L;高糖1组:含葡萄糖30mmol/L;高糖2组:含葡萄糖40mmol/L;LBP+高糖1组:含葡萄糖30mmol/L+LBP(1g/L);LBP+高糖2组:含葡萄糖40mmol/L+LBP(1g/L);于1d、3d、5d、7d进行指标检测。倒置显微镜下观察细胞形态的变化;以辣根过氧化酶(HRP)作示踪剂用二室弥散系统检测RF/6A单层通透性,免疫荧光法观察细胞骨架的变化、Western blot检测ROCK1、Occludin和P-MLC的蛋白表达量,并进行半定量分析。 结果: 1.LBP对DM大鼠血糖、血脂及血—视网膜屏障渗漏的影响: (1)血糖变化:LBP干预后的各组大鼠对应同时期的DM大鼠的血糖均有明显下降,4w时血糖下降幅度为57%,8w时下降幅度为40%,12w血糖下降幅度为36%,其降血糖效果以4w最为明显,随着病情的进展LBP的降糖效果有所减弱,下降率基本稳定在35%~40%之间。 (2)体重的变化:DM组成模后,开始出现消瘦,体重下降或增加缓慢,明显低于相同时间段的其他两组大鼠的体重。而LBP组则体重与正常对照组比较略有下降,明显好于DM组。 (3)血脂的变化:DM组12w时甘油三酯基本达到正常值的3倍,而LBP组12w时甘油三酯的浓度有轻度上升。12w时DM组总胆固醇浓度是正常对照组的1.4倍;而LBP组胆固醇浓度与正常组基本无差异p0.05。 (4)EB在血—视网膜屏障渗漏的变化:DM组大鼠EB渗漏量4w、8 w、12 w分别增加了2.1倍、2.3倍、2.7倍。而枸杞多糖组较糖尿病组以上三个时间点EB渗透量降低了50%、40%、27%,组间比较p0.01。前4w保护作用表现就的最明显。 2.LBP对DM大鼠血—视网膜屏障形态学变化的影响: (1)HE染色光镜观察: 12wDM组神经纤维层断裂明显;节细胞、内颗粒层细胞排列明显紊乱;毛细血管明显扩张,数量增加。4wLBP组、8wLBP组各层组织形态与正常组织基本无明显差别,12wLBP组仅出现内、外颗粒层排列稍有不规则,毛细血管的轻度扩张。 (2)视网膜血管铺片:12w DM组毛细血管网迂曲,扭结,某些部位出现节段性膨大,管腔狭窄甚至闭塞。周细胞和内皮细胞有所减少;12wCON DM、LBP组VEGF灰度值216.13±2.71、105.30±4.25、176.72±4.31。组间有明显差异p0.05,DM组并随着病程的进展,VEGF表达的量不断增高。 (3)电镜下超微结构的改变:12w DM组大鼠视网膜基底膜进一步增厚,血管内皮细胞及周细胞肿胀,胞质内线粒体肿胀变性,管腔可出现扩张。视杆细胞膜盘模糊,出现溶解、断裂,间隙进一步扩大。12w LBP胞质内部分线粒体轻度肿胀变性,基底膜增厚不明显,毛细血管壁完整,管腔无扩张。视杆细胞,膜盘结构略有些模糊,结构开始出现紊乱,但纹理尚清。 3.枸杞多糖对糖尿病大鼠血—视网膜屏障保护作用机理的研究: (1)免疫组化法检测的Occludin表达:主要分布在视网膜内五层上。灰度值12w时,CON组143.70±2.29;DM组173.18±3.78;LBP组153.02±3.59,DM组表达较正常对照组显著减少。随着糖尿病视网膜病变时间的延长而逐渐下降。8w各治疗组与DM组比较,Occludin表达量明显增加。F+L组效果最好(p0.05),LBP与Fasudil组之间无明显差异(p0.01) (2)免疫组化法检测的ROCK1表达:主要分布在神经节细胞层和内颗粒层,灰度值12w时,CON组178.32±5.92;DM组155.91±2.76;LBP组178.82±4.33,DM组从4w开始减弱,并随着病程的延长,ROCK1表达的量逐渐增加,而LBP组ROCK表达量并没有明显的增加。各治疗组间比较,F+L组与正常组无明显差异(p0.05),治疗效果最好,Fasudil组的作用要比LBP的效果明显一些(p0.05)。 (3)免疫印迹法检测Occludin蛋白表达:DM组随着病程的延长,Occludin蛋白的量逐渐下降,组间有明显差异p0.01,而LBP组3.57±0.58;F组3.65±0.71;F+L组4.48±0.53,LBP组与F组比较LBP组表达略低,但无明显统计学意义P0.05。F+L组表达量高于其他两治疗组p0.01,与CON组相接近。 (4)免疫印迹法检测ROCK1蛋白表达:各组DM组大鼠ROCK蛋白表达随着病程的延长量逐渐上升,组间有明显差异p0.01;而LBP组3.14±0.51;F组3.05±0.42;F+L组2.62±0.51,LBP组与F组比较LBP组表达略高,有统计学意义p0.05。F+L组表达量高于其他两治疗组p0.01,与CON组相接近。 (5)免疫印迹法检测P-MLC蛋白表达:各组DM组大鼠ROCK蛋白表达随着病程的延长量逐渐上升,组间有明显差异p0.01,而LBP组2.97±0.42;F组2.78±0.53;F+L组2.44±0.47,LBP组与F组比较LBP组表达略高,有统计学意义p0.05。F+L组表达量高于其他两治疗组p0.01,与CON组相接近。 4.枸杞多糖对高糖培养下视网膜血管皮细胞Rho/ROCK信号传导通路的影响:(1)正常RF/6A呈单层扁平上皮状,高糖2组7d组内皮细胞收缩明显,有的伸出长长的伪足,边界模糊,细胞间形成明显的裂隙,细胞生长数量明显较对照组少。高糖1组则于5d后形态开始出现变化。而LBP+高糖1组、LBP+高糖2组,仅于7d时,细胞略有些变圆,细胞数量略少。 (2)RF/6As单层通透性的变化:3、5、7 d高糖组HRP的光密度值明显高于正常对照组(p0.01),尤其高糖2组渗漏更加明显。而LBP则能逆转这种因高糖造成的渗漏(p0.01)。尤以LBP+高糖1组效果较理想,与对应的高糖1组通透性明显降低(p0.01)(3) F-actin形态及分布的变化:对照组F-actin分布均匀,呈网状有序排列,细胞相互融合,连接紧密。高糖2组7d外周致密带明显断裂,胞质内应力纤维断裂,细胞周边出现“绒毛状”短的指状突起,“空洞状”裂隙增大,细胞近似脱落状态。LBP+高糖2组7d外周致密带进一步变细,并且部分出现断裂,细胞间开始出现裂隙,但细胞形态明显好于高糖7d组。(4)ROCK1蛋白表达量:随葡萄糖浓度的增加而升高,与β-actin的光密度比值,正常组0.54±0.25、高糖1组0.85±0.31、高糖2组1.321±0.38,高糖1组和高糖2组与对照组比较p0.01,而这种增高趋势能被LBP所逆转,在葡萄糖浓度为30mmol/L的条件下LBP抑制ROCK1表达的作用更明显。(5)P-MLC蛋白表达量:表达量随葡萄糖浓度的增加而升高,与β-actin的光密度比值,正常组1.34±0.25、高糖1组2.45±0.31、高糖2组3.32±0.38,高糖1组和高糖2组与对照组比较p0.01,LBP抑制P-MLC表达的升高,LBP+高糖1组1.38±0.27,LBP+高糖2组1.87±0.51。(6) Occludin蛋白表达量:随着葡萄糖浓度的增加Occludin蛋白表达量逐渐下降,LBP—高糖1组0.90±0.16,LBP—高糖2组0.69±0.14,各治疗组均可明显提升其相对应高糖组Occludin表达的量,有明显统计学意义p0.01,尤其LBP-高糖1组可明显抑制Occludin表达的量的下降。 结论: 1.LBP可以显著减低糖尿病大鼠的血糖、血脂并能降低血-视网膜屏障的渗漏。 2.LBP可以减低糖尿病大鼠的视网膜血管上VEGF的表达,并能减轻血管内皮细胞和周细胞的水肿,减少基底膜的增厚,并减轻视细胞的损害。3.DR的过程中确实存在着ROCK通路的激活,ROCK及其底物P-MLC表达的上调而该过程可以被LBP所阻断,减低以上信号分子的表达,通过稳定Occludin的表达,起到保护血-视网膜屏障的作用。4.LBP可以明显减轻体外高糖环境培养下的单层EC的渗漏,通过抑制ROCK及其底物P-MLC该信号通路,而起到稳定细胞骨架,维持紧密连接的作用。
【学位授予单位】:辽宁中医药大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R285.5

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3 徐国兴;郭健;;枸杞多糖和熊胆引流液对糖尿病大鼠视网膜保护作用[A];第十届全国中西医结合眼科学术会议暨第五届海峡眼科学术交流会论文汇编[C];2011年
4 侯笑伦;孙冰;王晗;王际辉;;枸杞中活性物质的提取及抗氧化活性的研究[A];中国食品科学技术学会第八届年会暨第六届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2011年
5 罗琼;阎俊;李瑾玮;张声华;;枸杞多糖粗品与纯品抗疲劳作用的比较[A];中国营养学会第五次营养资源与保健食品学术会议论文摘要汇编[C];1999年
6 罗琼;黄晓兰;杨明亮;阎俊;;枸杞多糖对雄性动物性功能及生殖功能的影响[A];中国营养学会第九次全国营养学术会议论文摘要汇编[C];2004年
7 徐国兴;郭健;;枸杞多糖和熊胆引流液对高糖诱导RPE氧化损伤的保护作用[A];第十届全国中西医结合眼科学术会议暨第五届海峡眼科学术交流会论文汇编[C];2011年
8 张小锐;周文霞;张永祥;齐春会;黄晏;王仲浮;王博;;TLR4是介导枸杞多糖LBPF4—OL免疫调节功能的重要作用位点[A];第十三届中国科协年会生物医药博士论坛论文集[C];2011年
9 罗琼;李瑾伟;张声华;;枸杞多糖——X组份对实验性四氧嘧啶糖尿病兔降血糖效果研究[A];中国营养学会第七届全国营养学术会议论文摘要汇编[C];1996年
10 齐春会;张永祥;谭余慶;黄琳娟;田庚元;;綴合物LbGp4和糖链LbGp4-OL的化学结构及其免疫药理作用机理[A];海峡两岸三地药理学学术报告会论文汇编[C];2001年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 赵红;枸杞产业急欲梅开二度[N];中国经营报;2001年
2 佟晓群;劲牌获两项国家专利[N];中国食品报;2011年
3 豆箐;“十全十妙”的枸杞[N];人民政协报;2004年
4 何彦丽 苏俊芳;中药多糖抗肿瘤免疫药理研究进展[N];中国医药报;2003年
5 陆珏婷;延缓衰老离我们还有多远?[N];大众科技报;2002年
6 宿健桃;药用植物中多糖类成分延缓衰老的作用[N];中国医药报;2001年
7 田海蓉;“护眼法宝” 枸杞子[N];医药经济报;2004年
8 宿健桃;药用植物多糖类成分药理作用综述[N];中国中医药报;2002年
9 中国中医科学院西苑医院 黄林英 张国玺;酒后,用中药给肝做急救[N];健康时报;2009年
10 郑 文;特殊养分的保健绝活[N];大众科技报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王建华;枸杞多糖的结构与保健功能评价[D];华中农业大学;2001年
2 甘璐;枸杞多糖抗肿瘤机理研究—细胞凋亡、相关因子基因表达[D];华中农业大学;2001年
3 张民;枸杞多糖的特性、结构及生物活性评价——生物学前沿技术的应用[D];华中农业大学;2003年
4 罗琼;功能因子LBP的研究:LBP-X的特性及其生物活性[D];华中农业大学;1997年
5 何彦丽;枸杞多糖抗实验性肝癌作用的病理定量分析及免疫学机制研究[D];广州中医药大学;2006年
6 谭宇蕙;中药活性成分对自杀基因旁观者效应增效作用及机制研究[D];广州中医药大学;2005年
7 古赛;枸杞多糖防治大鼠酒精性脂肪肝的实验研究[D];重庆医科大学;2007年
8 赵蕊;LBP-4a改善胰岛素抵抗及治疗糖尿病肾病作用的研究[D];燕山大学;2007年
9 栗绍文;猪流产嗜性衣原体抗体ELISA检测与基因免疫研究[D];华中农业大学;2008年
10 倪同上;枸杞子提取物在病理模型中的探索性研究[D];山东大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 窦冉;枸杞多糖对蓝光诱导损伤的视网膜色素上皮细胞抗氧化作用机制的研究[D];山东中医药大学;2011年
2 郭琦;枸杞多糖的提取、分离纯化、溶液性质及其结构的初步研究[D];陕西师范大学;2012年
3 成日华;枸杞多糖对P-糖蛋白影响的研究[D];中南大学;2012年
4 尹瑞卿;枸杞多糖对肉仔鸡生产性能和免疫功能的调节作用[D];西北农林科技大学;2013年
5 杨茂兰;枸杞多糖对人视网膜色素上皮细胞抗衰老的影响[D];山东中医药大学;2011年
6 韩伟;补充枸杞多糖对大负荷运动小鼠部分免疫指标的影响研究[D];河南大学;2011年
7 许城燕;硒化枸杞多糖硫酸酯的制备及其体外生物活性研究[D];河北大学;2010年
8 吴庆秋;枸杞多糖对氧化应激诱导2型糖尿病大鼠周围神经细胞凋亡的保护作用及其机制研究[D];宁夏医科大学;2010年
9 李晓彩;枸杞多糖对双酚A所致小鼠睾丸生精细胞凋亡的抑制作用研究[D];河北农业大学;2012年
10 赵亚兵;枸杞多糖对大鼠睾丸支持细胞辐射损伤的恢复作用[D];郑州大学;2012年
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