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《沈阳药科大学》 2001年
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藤黄灰链霉菌发酵液中次生代谢产物的研究

司端运  
【摘要】: 藤黄灰链霉菌(Streptomyces luteogriseus)是从土壤中分离出来的放线菌,其 WC670号菌株的发酵液具有糖苷酶抑制活性。将发酵液经过提取和初步分离,得 到次生代谢产物的有效部位称为WC670。WC670对甜菜等糖料作物显示出了良 好的增糖效果;酶动力学实验发现对蔗糖转化酶和α-淀粉酶具有抑制作用;初步 化学研究表明为一非常复杂的氨基寡糖类混合物,其中可能含有已知的α-淀粉酶 抑制剂异戊他定类化合物。预计在农业和治疗糖尿病和肥胖症等方面具有开发潜 力。 本论文的主要目标是利用现代高通量化学筛选技术,结合传统的化学结构研 究方式,阐明WC670的化学组成;通过生物转化研究,丰富有关氨基寡糖类化 学成分药物代谢方面的资料,也为简化氨基寡糖类复杂混合物的化学组成、促进 WC670的深入开发提供思路和策略。 一、异戊他定系列化合物化学结构的深入研究 采用LC/MS技术研究WC670的化学组成,确认含有6个已知的异戊他定 系列化合物。但在仔细分析它们的结构研究资料时,发现文献所建立起来的化学 结构尚存在明显问题。以Spherisorb C_8柱(300×8.0mm,10μm)为固定相,不 同比例的乙腈-1.5mmol/L氨水为流动相,206nm下检测,对收集到的色谱峰流 分进行冷冻干燥,首次分离纯化出全部6个异戊他定已知化合物的单体。通过质 谱分析和葡萄糖淀粉酶催化的水解反应特点,确定了结构的组成单元及其连接顺 序;通过核磁共振光谱分析以及理化性质测试,分别修正了结构中的异戊酸应该 与D单元葡萄糖的6位羟基连接成酯、存在还原性的葡萄糖末端、结构中的苷 键全部呈α-(1→4)连接形式等,最终建立起了它们的准确结构,并重新命名为异 戊他定M03、M13、M23、D03、D13、D23。 在结构修正工作的基础上,初步总结出了异戊他定类化合物的结构与色谱行 为、电喷雾离子化质谱行为以及核磁共振光谱特征之间的规律,为进一步进行 WC670的化学组成研究奠定了基础。 二、藤黄灰链霉菌发酵液中次生代谢产物的化学组成研究 采用LC/MS技术分析WC670样品时,发现除了已知的6个异戊他定化合 物外,还存在葡萄糖个数、葡萄糖单元的连接顺序、伪三糖个数以及酯侧链形式 等发生变化的成分。将几种变化因素进行组合,计算出可能存在组分的分子量和 质谱检测时准分子离子及碎片离子的质荷比数值。以Spherisorb C_8柱(200×4.6 mm,5μm)为固定相,乙腈-1.5mmol/L氨水(15∶85,v/v, 0.5ml/min)为流动相, n 藤黄灰链霉菌发酵液中次生代谢产物的研究 设定质谱参数,对预测组分逐一检测。分析各色谱峰的保留时间和相应Cio质 谱图的特征碎片离子,发现WC670中至少含有异戊酸酯、丁酸酯、异己酸酯和 异己烯酸酯侧链的4大系列138种服绒类成分,其中132种是首次鉴定出 的新化合物,推测出它们的可能结构,并分别命名为异戊他定类osovalertatins* 丁他定类比 人异己他定类*sohex…s)和异己烯他定类Osohex聊- tatins)。通过Cio质谱图的离子强度数值,初步评价WC670中以 sed碳酯侧 链、l《个伪三糖、伪三糖左侧为0—3个葡萄糖以躺三糖右侧3个葡萄糖时 组合出的化合物为主要成分。 为了验证化学筛选结果的准确性,l从 WC670中制备出 * 个新化合物的 单体,通过核触振光谱分析等手段确认了它们的结构分别为异戊他定M33、异 戊他定D33、异戊他定D43、异戊他定T03、异戊他定T13、丁他定M03、T 他定M13、异己他定M33、异己他定M43、异己他定D23和异己他定D43, 均与LCMS分析所提示的化学结构相一致。 分析比较 13 8种眼黝类成分在 CS反才柱上的色飘为,与化学结构之 间存在如下的规律:O酯侧链对色渐为的影响最大。侧链中每增加 1个CHZ, 化合物的保留能力大大增强,保留时间延长。②伪三糖和葡萄糖的数目增加,分 子的极性加大,保留时间缩短。③位置异构体能得到较好的分离。当葡萄糖由连 接于伪三糖右侧改变到左侧时,保留时间缩短。 氨基寡糖化合物以色谱流动相溶解后进行ESI-MS分析,主要得到准分子离 子峰[M+H 椭二个以上仲胺结构的化合物,还可以出现叭2切 峰。对 仰卜田”和仰刊m”断CID分析,所得到的碎片离子都能够用于结构解析。 分析比较138种撼髓类成分的Cio质谱图,总结出质谱断裂规律:①主要 存在由于一个糖苦键或伪糖苦键断裂,产生包含有仲胺基团的碎片离子。②对 阶二田h赫 cro分析时,可以产生带二个正电荷的碎片离子。@鸡纳糖苦键 易发生断裂,伪糖普键次之,葡萄糖旮键再次。鸡纳糖苦键断裂形成的碎片离子 往往构咸Cio质谱图中的最强峰,容易识别,是解析各组成单元之间连接顺序 的主要依据。④碎片离子o刁 厂说明结构中存在非还原性六碳糖末端, [M们I 厂说明存在还原性的六碳糖末端,阶H上 厂和 d 304说明伪三糖 连接于分子的最左侧。⑤母离子及丰蹦大的碎片离子容易脱水,产生减少18 U 的碎片离子。 寡糖类化合物分子大,碳氢数目多,且多数为连接一个氧的脂肪碳氢结构, N’--
【学位授予单位】:沈阳药科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R917

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【参考文献】
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