收藏本站
《沈阳药科大学》 2001年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

人血小板生成素重组细胞的培养工艺研究

苏冬梅  
【摘要】: 本研究的内容主要是建立高密度、高表达培养TPO重组细胞的工艺。进 行了包括构建重组细胞株、确立重组细胞培养方法、建立TPO体外活性测定 方法、纯化和鉴定表达产物等一系列实验。 首先将带有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的TPO表达质粒pTcho以电 穿孔法转入二氢叶酸还原酶缺陷的CHO(DHFR)细胞,通过条件培养基选 择及氨甲碟呤加压筛选,获得能够高效、稳定地表达rhTPO的细胞株,命名 为STPO-1。经细胞稳定性等多项指标的鉴定,证实该细胞可以作为生产细胞 株。 为了实现高表达细胞培养,通过实验选择了合适的培养基、pH值和表达 刺激物质等,确定了STPO-1细胞在瓶中的培养及表达方法。使细胞在瓶培养 时的TPO表达量达到2000U/ml(相当于7mg/ml)。为了进一步实现重组细 胞的高密度培养,利用生物反应器进行了大规模连续培养,摸索出了STPO-1 细胞在生物反应器中培养时合适的pH值、溶解氧值、转数、通气流量、葡萄 糖浓度和流加速度等,确定了STPO-1细胞在生物反应器中的生长及表达条件, 在体积为5L的生物反应器中,利用无蛋白培养基培养,细胞密度达6×10~6 个/ml,TPO表达量达12000U/ml(相当于40mg/ml),细胞密度和表达量均 达到了瓶培养的6倍,表达时间达24天,收获量达100L,收获液经纯化后可 得TPO蛋白650mg,并且在表达期间细胞代谢和表达量比较稳定。 为验证表达产物的结构,进一步对表达产物进行纯化,获得了均一的rhTPO 组分。经鉴定,产品的纯度大于99%,分子量为70-120KD,N端17个氨基 酸序列依次为Ser-Pro-Ala-Pro-Pro-Ala-Cys-Asp-Leu-Arg-Val-Leu-Ser-Lys-Leu- Leu-Arg,等电点小于5,免疫印迹为单一条带。 通过实验获得了能高效、稳定地表达重组TPO的细胞株,并建立起一套 完整有效的细胞培养及产物纯化技术。对大规模产业化生产和广泛的临床应用 打下了坚实的基础。 在研制过程中,确定了TPO在体外定量测定的方法,该方法简便、灵敏 沈阳药科大学硕士论文 人血小板生成素重组细胞的培养工艺研究 度高、重复性好,可做为常规方法推广使用。
【学位授予单位】:沈阳药科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:R915

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 刘丽,王颖,田生礼,芦兴武,孟岩,刘立忠,谢宝树,冷爱军;血小板生成素糖基化与其体内生物学活性关系的研究[J];免疫学杂志;1999年02期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 杨金辉;杨明;黄晶;张薷云;;地榆鞣质的制备及其对环磷酰胺致小鼠白细胞减少症影响的初步研究[J];中国医药生物技术;2013年01期
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 宪莹;儿童特发性血小板减少性紫癜血小板生成素研究[D];重庆医科大学;2003年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 刘存仁,张红卫;血小板生成素及其研究进展[J];生物化学与生物物理进展;1996年04期
2 蓝柯;血小板生成素的研究进展[J];重庆医科大学学报;1998年02期
3 柴玉波,赵忠良,刘慧萍,陈苏民;血小板生成素基因功能区段的体外扩增与序列测定[J];第四军医大学学报;1997年05期
4 柴玉波,赵忠良,刘慧萍,陈苏民;血小板生成素功能区段基因的克隆与表达[J];生物技术通讯;1997年Z1期
5 陈建魁,牟兆钦,黄士敏;血小板生成素的研究进展[J];军事医学科学院院刊;1995年04期
6 田生礼,刘丽,李玉新;利用聚合酶链反应鉴定重组TPO阳性克隆[J];东北师大学报(自然科学版);1997年01期
7 曹华,葛忠良;血小板生成素的研究进展[J];人民军医;1997年09期
8 赵建增!临床分子生物学研究中心,郭子宽!临床分子生物学研究中心,朴春艳!临床分子生物学研究中心,张国荣!临床分子生物学研究中心,王晓平!临床分子生物学研究中心,梅英杰!临床分子生物学研究中心;血小板生成素过量表达对T淋巴细胞增殖和分化的影响[J];空军总医院学报;1998年04期
9 张振龙,邓宛明,汤燕文;血小板生成素功能区段的构建、表达和生物学活性评价[J];微生物学免疫学进展;1999年02期
10 惠小阳,李巍;血小板生成素随儿童年龄增长的变化[J];国外医学.儿科学分册;2000年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 沈文红;赵益明;庞爱明;庄茜;阮长耿;;抗内皮细胞抗体和血小板生成素测定在ITP与SLE鉴别中的意义[A];中华医学会第八次全国血液学学术会议论文汇编[C];2004年
2 田生礼;郑敏;;定点诱变血小板生成素第301个氨基酸[A];新世纪 新机遇 新挑战——知识创新和高新技术产业发展(上册)[C];2001年
3 刘琳;;血小板减少症患者血清血小板生成素的测定[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年
4 高瑞兰;黄蔚;林筱洁;BengH.Chong;吴超群;;血小板生成素(TPO)诱导的细胞内信号途径涉及NF(?)B转录因子[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年
5 华宝来;邹农;樊晓红;赵永强;;重组人血小板生成素多疗程治疗难治性特发性血小板减少性紫癜一例[A];中华医学会第八次全国血液学学术会议论文汇编[C];2004年
6 徐卫红;高瑞兰;BengH.Chong;吴超群;;血小板生成素(TPO)诱导的人巨核细胞内转录调控蛋白NFêB磷酸化的研究[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年
7 巩路;周蕾;刘永玉;;类风湿关节炎患者血小板计数与血清血小板生成素的相关性研究[A];第十二届全国风湿病学学术会议论文集[C];2007年
8 林筱洁;高瑞兰;BengH.Chong;陈小红;吴超群;;蛋白激酶对血小板生成素(TPO)诱导的人巨核细胞内NF(?)B蛋白活性影响的研究[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年
9 丁汀;金洁;;200例血小板减少症患者血小板生成素和甲状腺激素水平的测定[A];第七届全国血液免疫学学术大会暨2008年浙江省血液病学术年会论文汇编[C];2008年
10 靖士侠;彭佐良;孙爱清;刘文斌;;特比澳的药理作用与临床应用[A];2006年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2006年
中国重要报纸全文数据库 前5条
1 陈咏梅;促血小板生成素临床应用前景广阔[N];医药经济报;2002年
2 ;十年磨砺阳光品牌[N];医药经济报;2003年
3 丁萍;卫材2.55亿美元收购AkaRx[N];医药经济报;2009年
4 程书权;使用长效干扰素应注意不良反应[N];健康报;2005年
5 吴瀚;血小板减少不再可怕[N];医药经济报;2002年
中国博士学位论文全文数据库 前5条
1 宁云山;人血小板生成素基因表达和调控的初步研究[D];第一军医大学;2001年
2 解纯刚;转THPO和FL膜外区基因骨髓间充质干细胞对脐血造血干/祖细胞的体外扩增研究[D];浙江大学;2006年
3 高蕾;人脐血源基质细胞促进巨核细胞增殖作用及机制探讨[D];第三军医大学;2008年
4 周利刚;血小板生成素、右丙亚胺在心肌损伤中的保护作用及其机制的研究[D];重庆医科大学;2010年
5 张薇;骨髓增生异常综合征异常造血克隆相关分子标志的研究[D];天津医科大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 郑敏;血小板生成素基因定点突变及其在毕赤酵母中的表达[D];首都师范大学;2000年
2 房丽华;血小板生成素与血小板和巨核细胞计数的相关性研究[D];山西医科大学;2002年
3 宪莹;儿童特发性血小板减少性紫癜血小板生成素研究[D];重庆医科大学;2003年
4 张丽娟;重组血小板生成素对骨髓抑制小鼠的促血小板生成作用[D];中国医科大学;2002年
5 杨春燕;改良MAIPA、网织血小板与血小板生成素检测对免疫性血小板减少症的诊断价值[D];大连医科大学;2009年
6 张素珍;慢性肝病患者血清血小板生成素表达水平与循环血小板计数和肝功能关系的研究[D];山西医科大学;2005年
7 康旭丽;无创检查在血小板减少性紫癜诊断中的应用[D];山西医科大学;2005年
8 吴永霞;骨髓增生异常综合征和急性白血病患者血清血小板生成素水平的测定及临床意义[D];青岛大学;2009年
9 于慧;慢性淋巴细胞白血病IgH基因重排及血清sCD23、TPO研究[D];南京医科大学;2008年
10 陈芾珩;血小板生成素对大鼠阿霉素心脏毒性的保护作用及机制[D];汕头大学;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026