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吴茱萸碱抗肿瘤机制研究

张莹  
【摘要】: 本文对吴茱萸碱抗肿瘤活性进行了较为系统的研究,主要阐述了吴茱萸碱在三种肿瘤细胞:人黑色素瘤A375-S2细胞,人宫颈癌HeLa细胞,小鼠纤维肉瘤L929细胞中诱导细胞死亡的不同机制。 在测定吴茱萸碱对四种人源肿瘤细胞(黑色素瘤A375-S2细胞;宫颈癌HeLa细胞;急性单核白血病THP-1细胞;乳腺癌MCF-7细胞)和四种鼠源癌细胞(小鼠纤维肉瘤L929细胞;突变Buffalo大鼠肝癌BRL细胞;小鼠肉瘤S180细胞;小鼠宫颈癌U14细胞)细胞毒作用时发现四种人源癌细胞均对吴茱萸碱敏感,半数抑制浓度分别为:IC_(50)(A375-S2):14.7±1.9 μmol·L~(-1),IC_(50)(HeLa):15.4±0.7μmol·L~(-1),IC_(50)(THP-1):18.1±1.1 μmol·L~(-1),IC_(50)(MCF-7):22.7±1.3 μmol·L~(-1),但四种鼠源细胞中只有L929细胞对吴茱萸碱敏感,IC_(50)值为20.3±3.5 μmol·L~(-1)。与化疗药物放线菌素D,顺铂,及5-氟尿嘧啶对比,吴茱萸碱对人外周血单核细胞(PBMC)无细胞毒作用,这提示吴茱萸碱具有较强抗癌活性的同时毒副作用较小。 在A375-S2细胞中,Hoechst 33258荧光染色法证明吴茱萸碱作用细胞12h时出现明显凋亡小体,DNA电泳则表明吴茱萸碱作用24h时出现坏死特有的弥散泳带。采用LDH活力测定进一步证明吴茱萸碱处理细胞24h之内,细胞主要通过凋亡途径死亡,24h后坏死途径被启动。在吴茱萸碱诱导的早期凋亡途径中,caspase-3,8和9被激活,caspase家族抑制剂,caspase-3,8,9抑制剂均可显著抑制吴茱萸碱引起的凋亡,但这种作用在24h后即消失。应用Western blot法发现吴茱萸碱可明显上调促凋亡蛋白Bax的表达,而且同时下调抗凋亡蛋白Bc1-2的表达,这一切表明在早期吴茱萸碱诱导的凋亡是由caspase家族和Bc1-2家族共同调控的。吴茱萸碱作用细胞24 h后,p38抑制剂(SB203580)可部分抑制细胞死亡,与caspase家族抑制剂联用可增强这种抑制作用;与此相反ERK抑制剂(PD98059)可促进吴茱萸碱诱导的细胞坏死。我们进一步应用Western blot法证明吴茱萸碱虽不能影响p38蛋白表达但可上调磷酸化p38表达,即激活p38激酶;吴茱萸碱可减少ERK及磷酸化ERK蛋白表达。这些结果证明MAPK家族 调控着吴荣英碱晚期启动的坏死途径。流式分析结果表明吴茉英碱对A3 75.SZ 细胞周期无阻滞作用,细胞死亡发生于细胞周期各个阶段。 在HeLa细胞中,吴茉英碱启动了经典凋亡途径。荧光染色出现凋亡小体, DNA电泳呈现DNA梯状泳带,caspase家族抑制剂,c卿ase上,8,9抑制剂均可 显著抑制吴茉英碱引起的凋亡。c卿ase活力测定证明caspase上,8,9活力升高, 但caspase-8激活明显滞后于caspase-3和 caspase-9的激活。应用 Western blot 法证明吴莱莫碱可上调Bax表达但下调Bcl-2的表达。采用LDH活力测定法亦 证明吴莱莫碱在HeLa细胞中主要启动了凋亡途径而不象在A3 75S 细胞中还启 动了坏死途径。虽然JNK抑制剂(SP600125)可协同促进吴茉英碱在HeLa细 胞中的细胞毒作用,但吴荣美碱并不影响JN’K及磷酸化JN’K的表达。流式分析 术结果表明吴某某碱可将HeLa细胞周期阻滞在GZ/M期发生大量凋亡。 在L929细胞中吴莱莫碱诱导非经典性凋亡,虽然荧光染色出现凋亡小体, 且LDH活力测定表明吴某某碱引起的细胞死亡主要由凋亡途径进行,但DNA 电泳并未出现DNA Ladder,而且最为意外的是c呷ase家族抑制剂及caspase上 抑制剂可明显促进吴茉美碱引起的细胞死亡。流式分析结果表明低剂量5 卜mol*‘吴莱美碱可将细胞周期阻滞在 GZAI期,而高剂量 20 pmol·L“‘吴荣美碱 可将细胞周期阻滞在GO/GI期。 本文在证明吴荣英碱对癌细胞杀伤作用具有选择性,且对人外周血单核细胞 (PBMC)无细胞毒作用的基础上,首次探讨了吴茉英碱在A375* 细胞,HeLa 细胞和L929细胞中诱导细胞死亡机制,发现在三种细胞中吴某英碱发挥抗癌活 性机制各不相同,这可以进一步解释吴荣英碱抗癌作用的靶向性及选择性。


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