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与2型糖尿病相关的肥胖机制研究及药物治疗新靶点-MGAT的探讨

栾洋  
【摘要】: 糖尿病是以胰岛素抵抗和/或胰岛素分泌不足为特点的代谢综合症,临床主要表现为高血糖。2型糖尿病约占糖尿病总数的90%,其发病率在全球逐年增长。2型糖尿病的发病机制虽然尚不十分清楚,但肥胖被认为是主要诱因,如何改善肥胖是治疗2型糖尿病的研究方向之一。 本实验的目的是探讨肥胖产生的机制,寻找肥胖的致病因素,以此作为治疗肥胖和2型糖尿病的新靶点。 实验使用的动物为OLETF和LETO大鼠。OLETF大鼠是自然发病的肥胖型2型糖尿病模型动物,由日本大塚制药株式会社开发。它的发病过程及病理特征与人类2型糖尿病极为相似,因此该模型动物对研究肥胖和2型糖尿病的发病机制以及新药的开发是非常有价值的工具。LETO大鼠是同一近交系由来的完全不发病动物,用作正常对照。 OLETF大鼠有明显的过食症状,因此,首先对动物限食,纠正其过食行为后,观察肥胖和糖尿病的改善程度。动物分为OLETF限食组、OLETF饱食组(动物自由摄食)和LETO对照组。限食组动物从断乳后5周龄起至21周龄,每日与LETO大鼠进食等量饲料。逐日测定动物体重。限食结束后,考察动物体脂肪、内脏脂肪、肝脏内脂肪、血浆甘油三酯和脂肪酸含量的变化,评价肥胖的改善程度;进行糖耐量实验、测定血浆中葡萄糖、胰岛素和瘦素含量,评价糖尿病的改善程度。结果为,与饱食组相比,限食组OLETF大鼠的肥胖和胰岛素抵抗症状明显改善;与LETO对照组相比,限食组OLETF大鼠的体重没有显著性差异,但体脂肪和内脏脂肪相对重量显著增多,同时仍表现有高胰岛素血症和胰岛素抵抗。结果表明,过食是导致OLETF动物肥胖和糖尿病的原因之一,但是除过食外,还有其他因素存在。 为寻找过食之外肥胖和糖尿病的致病因素,以限食后的动物为研究对象,进行下一步实验。从脂肪代谢的角度出发,实验考察了脂肪代谢中的关键酶—脂蛋 沈阳药科大学博士学位论文摘要 .口古亩亩曰亩奋.目...百亩亩亩亩奋亩亩亩亩亩古亩亩曰亩奋亩亩百面云亩亩亩亩亩亩亩亩亩亩亩亩亩亩亩亩亩亩亩亩亩亩亩面亩亩亩亩亩 白脂肪酶(LPL)、甘油二醋转酞基酶(DGAT)和甘油一酷转酞基酶(MGAT) 的活性。其中,LPL是中性脂肪水解酶,DGAT是脂肪合成的最终步骤酶,MGAT 存在于小肠中,是控制外源性脂肪再合成的关键酶。结果表明,注射肝素后血浆 中的LPL活性在OLETF饱食组中异常降低,在限食组中没有异常,认为LPL活 性的异常是由过食引起,不是肥胖的原因而是结果。DGAI,活性在三组之间没有 显著性差异。MGAT活性在OLETF限食组和饱食组均显著升高,认为MGAT活 性的升高是与过食相独立的引起OLETF大鼠肥胖和2型糖尿病产生的原因之 一。故可认为,活性异常的MGAT可能成为治疗肥胖和2型糖尿病的一个新靶 点。 现有的MGAI,活性测定法,操作步骤繁琐,浪费时间和试剂,很难应用于 新药的筛选。进一步的实验试图开发出简便有效的新方法。受分子生物学中分子 杂交技术的启发,利用酶与底物特异性结合的原理,本实验采用同位素标记和膜 印迹法进行酶活性的测定。实验选择亲脂、亲蛋白性的聚偏氟乙烯(PVDF)膜 作为固相支持物,将底物2一甘油一醋(2一MG)固定在膜上,置于96孔板中, 加入同位素标记的软脂酞辅酶A([l一‘4C]Pal一coA)和MGAT启动反应开始,反 应结束后,洗膜除去未反应的[1一‘4C]Pal一CoA,生成物甘油二酷吸附在亲脂性PvDF 膜上,检测放射能。 考察PVDF膜与底物结合的稳定性;设计不同阴性对照,分析膜上发生的反 应。结果表明,在一定浓度表面活性剂的存在下,底物与膜仍可稳定结合。反应 限定在膜上发生,膜上生成的产物可以被检测和定量。进一步的实验考察反应时 间、酶蛋白量和底物浓度对反应的影响,确定最适反应条件,建立MG户a,活性 测定法。将确立的方法应用于目标化合物的筛选,得到的化合物BOF可以剂量 依赖性地抑制MGAr的活性,具有进一步研究和开发的价值。 应用PVDF膜印迹法测定MGAT活性的方法,准确、简便和高效,具备筛 选化合物的能力,国内外均未见文献报道。期待这个新方法能对脂质研究技术和 酶活性测定方法的开发提供一种新思路。


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1 屈炼;黄牛MGAT基因遗传变异及其与生长性状相关分析[D];西北农林科技大学;2011年
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