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两种天然倍半萜的抗肿瘤活性及其生合成中酶的基因克隆

任杰  
【摘要】:抱茎苦荬菜[Crepidiastrum sonchifolium(Bunge)]是菊科苦荬菜属植物,盛产于我国东北、华北。其化学成分复杂多样,其中的倍半萜内酯类化合物有显著的生物活性。 本文利用大孔吸附树脂柱层析、硅胶柱层析等方法从抱茎苦荬菜中分离出含有两个活性倍半萜内酯苷成分的组合物并应用制备高效液相色谱,最终得到两个单一成分的化合物。利用光谱分析对二者进行结构鉴定,认定其分别为1(10),3,11(13)-愈创木三烯-12,6-内酯-2-酮-3-O-吡喃葡萄糖苷(苷1)和1(10),3-愈创木二烯-12,6-内酯-2-酮-3-O-吡喃葡萄糖苷(苷2)。 在活性内酯苷组合物的基础上,将葡萄糖基水解掉,成为内酯苷元组合物,再通过乙酸乙酯萃取,氧化铝柱层析等方法将组合物分离,分别得到两个苷元的单体。利用光谱分析对二者进行结构鉴定,认定其分别为3-羟基-1(10),3,11(13)-愈创木三烯-12,6-内酯-2-酮(苷元1)和3-羟基-1(10),3-愈创木二烯-12,6-内酯-2-酮(苷元2)。 将分离得到的四种化合物进行体外抗肿瘤活性实验。首先利用MTT法,测定它们对肿瘤细胞(A375-S2,Hela和L929)的细胞毒活性。结果表明,内酯苷和苷元对三种细胞都显示出了一定的增殖抑制活性,其中内酯苷元诱导上述细胞死亡呈剂量依赖关系且活性明显高于内酯苷。形态学方法表明内酯苷元组合物诱导A375-S2细胞,HeLa细胞和L929细胞的死亡机制为诱导细胞凋亡。 为研究苷元所诱导的细胞毒活性的机制,本文利用猿猴病毒(SV40)体外DNA复制系统检测了苷元对DNA复制过程的抑制作用,发现苷元1和2均能剂量依赖性地抑制SV40体外DNA复制。为探讨苷元是否通过抑制复制反应所需要的重要的复制蛋白来抑制DNA复制,本文检查了苷元对复制蛋白A(RPA)的单链DNA结合活性的影响。结果表明,苷元1能够剂量依赖性地抑制RPA与单链DNA的结合能力。在浓度达到250μmol/L的时候,超过70%的RPA的单链DNA结合能力被抑制。 为了检测苷元抑制细胞增殖是否通过调节细胞周期的作用,我们利用流式细胞术检测了苷元对A549细胞的细胞周期的影响。结果表明,苷元能够诱导细胞周期阻滞在G2/M期。


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