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《沈阳药科大学》 2007年
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钳蝎镇痛抗肿瘤肽结构与功能关系的初步研究

吴小燕  
【摘要】:东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch,BmK)镇痛抗肿瘤活性肽(analgesic-antitumor peptide,AGAP)是一种既具有镇痛活性又具有抗肿瘤活性的蝎毒素。基因序列长198bp,编码66个氨基酸残基。 本实验是通过BmK-AGAP羧基末端一级结构的改变对镇痛活性的影响,研究BmK-AGAP及其突变体的结构与功能关系。首先,通过DNA重组技术将BmK-AGAP基因克隆至表达载体pET-28a(+)中,并将构建好的重组质粒pET-28a-Tag_((His))-AGAP转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,15%SDS-PAGE进行电泳,利用蛋白电泳分析软件Glyko BandScan Version 5.0进行谱带分析,得知表达产物Tag_((His))-AGAP的量约占菌体总蛋白的35%,但是几乎全部以包涵体的形式存在。 随后实现BmK-AGAP基因及其突变体在大肠杆菌中的可溶性表达。原有的BmK-AGAP基因3’端编码2个Gly,设计不同的下游引物,将这2个Gly的密码子逐一去除,得到3’端只带1个Gly密码子的突变体基因AGAP-C-1和3’端不带Gly密码子的基因AGAP-C-0。将BmK-AGAP及其突变体分别克隆至表达载体pSYPU-1b中,构建pSYPU-1b-Tag_((His))-AGAP-C-2、pSYPU-1b-Tag_((His))-AGAP-C-1以及pSYPU-1b-Tag_((His))-AGAP-C-0三个重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,三种目的蛋白均以可溶性的形式存在。 通过金属螯合层析以及阳离子交换层析的方法,从超声破碎的菌体上清中分离纯化出融合蛋白Tag_((His))-AGAP-C-2、Tag_((His))-AGAP-C-1、Tag_((His))-AGAP-C-0,经纯化得到的目的蛋白均达到了电泳纯。小鼠醋酸扭体法测定镇痛活性实验中,采用腹腔注射给药途径,相同给药剂量0.1364μmol/kg时,三种蛋白Tag_((His))-AGAP-C-2、Tag_((His))-AGAP-C-1及Tag_((His))-AGAP-C-0均表现出了活性,扭体反应抑制率分别为28.76%(p<0.01)、62.33%(p<0.01)、81.74%(p<0.01),随着Tag_((His))-AGAP羧基末端两个甘氨酸残基的逐渐缺失,其镇痛活性呈递增趋势。
【学位授予单位】:沈阳药科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R284

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