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《沈阳药科大学》 2008年
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乙醇的基因毒性及原花青素的保护作用研究

郭磊  
【摘要】: 乙醇滥用是世界范围内严重危害人类健康的问题。对乙醇基因毒性及作用机制的研究有助于更好的预防和治疗乙醇中毒性疾病。乙醇引起的基因毒性作用机制尚不十分清楚,通常认为自由基的产生起着十分重要的作用。本论文从整体水平、细胞水平及分子水平对乙醇的基因毒性进行研究,对可能作用机制进行探讨,并对天然抗氧化物质的保护作用进行考察。 本论文首先采用单细胞凝胶电泳技术来考察乙醇对小鼠外周血细胞DNA的影响,同时应用HPLC-ECD来检测乙醇对小鼠尿液中8-OHdG生成的影响,并考察了乙醇对外周血细胞内ROS释放的影响和总抗氧化能力的变化,对乙醇引起氧化DNA损伤的可能机制进行探讨。结果表明,急性及长期给予乙醇(2.5g/kg,5.0g/kg)可以引起小鼠外周血细胞DNA损伤,同时外周血细胞内ROS显著增加,尿液中DNA氧化损伤的分子标志物8-OHdG也明显增加。上述实验结果提示,乙醇所引起的这种DNA损伤源自于乙醇所导致的氧化应激,为乙醇引起机体外周血细胞基因毒性提供了直接的理论依据。 中枢神经系统是乙醇主要作用靶点。在已经证明乙醇急性及长期给药可以引起小鼠外周血细胞DNA损伤的基础上,本论文进一步考察乙醇急性和长期给药及停药对小鼠不同脑区(大脑皮质、海马、纹状体、下丘脑、小脑)脑细胞DNA的影响,并确定乙醇引起中枢神经系统基因毒性的特异性脑区。同时应用气相色谱技术检测乙醇给药后动物不同脑区内乙醇及其代谢产物乙醛的分布情况,为乙醇引起特定脑区DNA损伤提供数据支持。结果表明,乙醇急性给药可以显著引起小鼠小脑及海马脑细胞DNA损伤,在乙醇给药后的4小时DNA损伤达到高峰;乙醇长期给药30天则可以引起小鼠小脑、海马、下丘脑及大脑皮质脑细胞DNA损伤,这四个脑区可能是乙醇长期基因毒性作用的靶向脑区;而乙醇(5.0g/kg)急性给药后,乙醇及其主要代谢产物乙醛在小鼠不同脑区内的含量不同,乙醇在小脑及海马的含量较高,该结果提示乙醇引起小脑及海马脑细胞DNA损伤可能与乙醇在此二个脑区内的含量较高有关。 自由基在乙醇的神经毒性作用中起着重要的作用。本研究证明乙醇可以引起自由基的过度产生,从而引起DNA的氧化性损伤。我们推测外源性抗氧化剂对乙醇所引起的氧化性DNA损伤应该具有一定的保护作用。本论文在确证乙醇具有中枢神经系统基因毒性的基础上,考察了抗氧化剂的保护作用。研究表明,葡萄籽提取物原花青素及其他一些常用抗氧化剂,如抗坏血酸、维生素E及白藜芦醇等,可以显著抑制乙醇引起的脑细胞DNA损伤,为原花青素等抗氧化剂可以拮抗乙醇的神经基因毒性提供了直接证据。 本论文研究表明小脑和海马是乙醇基因毒性的主要作用靶点,尤以小脑损伤最为严重。进一步应用原代培养的大鼠小脑颗粒细胞作为研究对象,在考察乙醇对小脑颗粒细胞DNA影响的同时,检测细胞内ROS生成情况,并以OGG1和HO-1基因的mRNA表达水平来评价DNA修复活性和氧化应激防御状态,同时考察葡萄系列提取物及红葡萄酒提取物对乙醇引起小脑颗粒细胞DNA损伤的保护作用及可能的作用机理。结果表明,乙醇(50,100,200mM)作用2,4,6,12,24h可以引起大鼠小脑颗粒细胞DNA的损伤,具有一定的时间浓度依赖性;乙醇100mM作用6h可以显著增加小脑颗粒细胞内ROS的生成;乙醇100mM作用于小脑颗粒细胞3h和6h均可引起细胞内OGG1和HO-1的mRNA表达增加,并在乙醇作用3h达峰,提示乙醇作用于细胞后可以引起抗氧化防御系统及DNA修复系统的代偿性调节;葡萄及红葡萄酒提取物在不影响细胞存活率的情况下,对乙醇引起的小脑颗粒细胞DNA损伤具有显著的保护作用。 综上所述,乙醇具有基因毒性作用,尤其是神经基因毒性作用,该作用与乙醇引起机体内的氧化应激有关。天然抗氧化剂——葡萄及红葡萄酒提取物,主要是原花青素类化合物对乙醇引起的氧化性DNA损伤具有显著的保护作用,提示这些抗氧化物质可以应用到预防和治疗乙醇滥用相关性的中毒性疾病中。
【学位授予单位】:沈阳药科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R285.5

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