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《沈阳药科大学》 2009年
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胸腺五肽干粉吸入剂的研究

王蕾  
【摘要】: 胸腺五肽(Thymopentin,TP5)是一个人工合成的寡肽,为胸腺生成素Ⅱ的免疫活性中心。TP5可诱导T细胞的分化、增殖和成熟,活化或调节不同T细胞亚群的数目和功能,实现对整个机体免疫系统的双向调节。临床上采用肌内或静脉注射给药,用于恶性肿瘤、慢性肝炎、严重感染、糖尿病及自身免疫性疾病等的治疗与辅助治疗。本文研究了用于肺部给药的TP5干粉吸入剂,可作为注射剂的替代给药方式,以解决长期频繁注射引起的患者依从性差的问题。 本文首先建立了包含制剂理化性质和雾化性能两类指标的干粉吸入剂质量评价体系。制剂理化性质包括引湿性、水分含量、粒子表面形态、粒度及其分布、密度和流动性的测定;雾化性能指标为排空率和体外沉积率。以扫描电镜、激光散射、热重分析及双级液体碰撞器等作为分析手段。选择HPLC法测定TP5含量,该方法专属性好,重现性、精密度、回收率均符合规定,TP5在0.15 mg·mL~(-1)~2.25 mg·mL~(-1)浓度范围内,浓度与峰面积线性关系良好,回归方程及相关系数为A=910687·C-53447,r=0.9999。 采用肺灌洗法提取大鼠肺表面的酶,灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)收率大于80%,酶解反应重现性良好。实验结果表明肺部酶对TP5有较强的水解能力,在稀释10倍的BALF中TP5半衰期为49.2 min;稀释300倍的BALF对TP5仍有水解能力,但反应速率降低。在选定的反应条件下,酶解反应呈零级过程。考察了常用的吸入剂添加剂,如乳糖、甘露醇、氨基酸、泊洛沙姆188及壳聚糖等对TP5酶解速率的影响,结果表明亮氨酸和苯丙氨酸可延长TP5的酶解半衰期至原来的2倍以上,分别为112.7 min和136.2 min;壳聚糖也有类似作用,可使TP5半衰期延长至85 min,且酶抑制效果与其分子量无关。上述辅料的酶抑制机制为:辅料分子与TP5分子在溶液中带相反电荷,两者通过静电引力作用形成离子复合物;复合物可改变TP5分子的伸展性,并使空间位阻增加,从而阻碍了酶催化中心与TP5分子的结合,使酶解反应速率降低。经分析可能有两种肺酶参与TP5水解:中性内肽酶从肽链的C末端水解掉两个氨基酸残基,氨肽酶从肽链N末端水解掉精氨酸。两种酶解途径中,内肽酶的催化速率要高于氨肽酶。 制备了以甘露醇、乳糖和亮氨酸为载体的TP5普通干粉吸入剂,对不同处方组成的吸入剂的理化性质及吸入性能进行考察,结果表明处方组成可显著影响吸入剂的理化性质,进而影响粉末的雾化性能。流动性良好且具有较小空气动力径的轻质粉末表现出较好的吸入效果。亮氨酸能降低粉末密度,提高干粉吸入剂体外沉积率。当处方中亮氨酸含量63%时,粉雾剂获得较佳的雾化性能。另外,处方中加入少量F68可以显著改善粉末的流动性。优化的处方组成为TP5/甘露醇/亮氨酸=10/18/72,含2%的F68,其振实密度为0.31 g·cm~(-3),空气动力径为1.9μm,体外沉积率达为45%。 采用喷雾干燥法制备TP5壳聚糖微球,以收率、粉末流动性对处方进行初步评价,结果表明微球处方中必须加入一定量的亮氨酸才能满足肺部吸入要求。优选的处方为TP5/壳聚糖/亮氨酸=10/45/45,含2%F68。另外发现TP5在喷雾干燥过程中与壳聚糖相互作用,形成了不可逆的复合物,导致粉末中药物含量下降至75%。 制备了含壳聚糖纳米粒的TP5干粉吸入剂。首先利用离子凝胶化法制备TP5壳聚糖纳米粒,对制备工艺进行单因素考察。以纳米粒粒径和包封率为指标,分别考察了CS和TPP溶液的浓度、CS与TPP质量比、pH值和药物加入量对纳米粒质量的影响,结果表明上述因素均对纳米粒的粒径和包封率均有影响。最终确定壳聚糖纳米粒的处方为:CS:TPP为3:1,CS:TP5为2:1。纳米粒粒径为276.1±50.7 nm,包封率为17.2%,载药量为5.4%。载药纳米粒的酶解实验显示TP5部分被物理包裹入纳米粒,部分吸附于纳米粒表面。将载药的纳米粒与亮氨酸以76:24的质量比混合后喷雾干燥,制得含纳米粒的干粉吸入剂。此干粉吸入剂与壳聚糖微球相比,粉末的流动性和排空率相当,但引湿性显著下降。含量测定的结果显示药物百分含量提高至97%,表明将药物载入纳米粒后再喷雾干燥减少了TP5的损失。 在处方中药物比例均为20%时,含高浓度亮氨酸的普通干粉吸入剂沉积率最高,达41.2%,壳聚糖微球的沉积率为25.4%,略高于含纳米粒的干粉吸入剂(20.8%)。 采用多指标综合评价法优化TP5干粉吸入剂的制备工艺,极差分析结果表明,雾化压力对吸入剂的质量影响最大,其他工艺因素依次为干燥风速供液速度入口温度,最佳工艺条件为雾化压力:190 kPa;干燥风速:0.7 m~3·min~(-1);供液速度:7.0mL·min~(-1);入口温度110℃。 应用HPLC结合微渗析法测定大鼠肺粘液中TP5的局部药代动力学。实验结果表明,微渗析探针的相对回收率与传递率不等,相对回收率较低,其平均值为3.7%。考察了大鼠气管内滴注TP5溶液及气管内给予不同处方组成的TP5干粉吸入剂后,TP5在肺粘液层中的浓度-时间变化情况。结果显示,干粉吸入剂可迅速溶解于肺粘液中。经过剂量校正后,普通干粉吸入剂、壳聚糖微球、含纳米粒的干粉吸入剂在肺粘液中的AUC_(ELF)/dose分别为25.15±10.98,14.94±7.35和8.81±6.11,均大于溶液剂滴注的AUC_(ELF)/dose 1.55±1.02;干粉吸入剂在肺内的滞留时间分别为8.92±1.19 min,10.71±1.18 min和8.94±2.74 min,高于溶液剂的6.71±1.49 min。说明粉末雾化给药有效延长了TP5在肺部的滞留时间,有利于增加药物的吸收。 进行了干粉吸入剂给药后大鼠体内的药效学研究。以环磷酰胺为造模药物,建立大鼠免疫抑制模型。分别以静脉注射TP5及肺部吸入TP5的方式对免疫失衡大鼠进行治疗。选择外周血中T细胞亚群CD_4~+/CD_8~+比值作为检测指标,采用流式细胞术对各组大鼠进行测定。实验结果显示,大鼠连续三天腹腔注射环磷酰胺后,血中CD_4~+/CD_8~+均值由正常的1.84下降至1.03,说明造模成功。免疫抑制大鼠经过静脉注射TP5或给予不同处方吸入剂干预后,其CD_4~+/CD_8~+均值分别恢复至2.29,1.94,1.52和1.81,说明肺部吸入TP5可产生与静脉注射相同的疗效。不同处方的干粉吸入剂疗效与体外沉积率有一定相关性,处方组成为TP5/甘露醇/亮氨酸的粉末体外沉积率最高,治疗效果最好。 考察大鼠肺部连续给予TP5干粉吸入剂的安全性,结果表明吸入剂对肺部有一定的刺激性。组织学检查显示支气管及肺泡上皮的通透性有所改变,有炎性细胞浸润,但无严重刺激性及成纤维细胞增生现象,损伤具有可恢复性。经统计分析,含TP5/甘露醇/亮氨酸的干粉吸入剂及含壳聚糖纳米粒的干粉吸入剂刺激性较小,与空白对照组相比无显著性差异,说明这两种处方的安全性更高。结合药效学实验结果,处方组成为TP5/甘露醇/亮氨酸=20/16/64(2%F68)和TP5纳米粒/亮氨酸=74/26(含20%TP5,w/w)的TP5干粉吸入剂更适于肺部给药。
【学位授予单位】:沈阳药科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R94

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