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《沈阳药科大学》 2010年
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雷帕霉素类抗肿瘤药物疗效预测的候选生物标记物研究

陈光  
【摘要】: mTOR信号通路参与控制细胞生长增殖、凋亡、代谢、蛋白质翻译合成、血管新生以及细胞周期调控等重要过程,被认为是细胞增殖的中心调控者。肿瘤细胞中遗传学上的改变和生化条件异常变化往往引起该信号通路的高度激活,mTOR靶蛋白已成为一类极具吸引力的肿瘤治疗靶点。 雷帕霉素是最早发现的mTOR特异性抑制剂,其类似物CCI-779和RAD-001分别于2007年5月和2009年4月通过FDA审评认证,作为晚期肾癌患者的治疗用药进入临床应用。同时,雷帕霉素及其类似物CCI-779、RAD-001、AP-23573用于治疗其它肿瘤的临床研究也在广泛的进行。虽然雷帕霉素类似物在临床前研究阶段多表现出良好的抗肿瘤作用,但在多数临床试验中该类化合物抗肿瘤效应普遍较温和、且个体差异较大。因此,筛选和确认能够预测雷帕霉素类似物疗效的生物标记物势在必行,以便开展此类药物的临床个体化治疗。 本研究课题利用生物信息学手段从整个基因组范围内对比了雷帕霉素及其类似物CCI-779对NCI 60株肿瘤细胞的活性(GI50)与9706个基因探针的基础表达水平,发现细胞对雷帕霉素类药物的敏感性与细胞p27/KIP1基因的表达水平呈显著正相关。选用8株乳腺癌细胞株对上述相关性分析结果进行验证发现,MCF-7、T47D、BT-474细胞p27/KIP1在mRNA和蛋白水平上的表达均明显高于MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、BT-549细胞。雷帕霉素及CCI-779对p27/KIP1表达水平较高的MCF-7、BT-474、T47D等细胞增殖抑制活性高于其对MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435等p27/KIP1表达水平低细胞的抑制活性;雷帕霉素类似物诱导肿瘤细胞G1期阻滞的作用亦与细胞p27/KIP1基础表达水平呈正相关性。此外,下调p27/KIP1的表达水平可显著降低雷帕霉素类似物对MCF-7、BT-474细胞的增殖抑制及G1期阻滞作用。这种正相关性进一步在体内实验中得到了验证,雷帕霉素对p27/KIP1基础表达水平高的人癌细胞裸鼠移植瘤显示出更强的生长抑制作用。相关机制研究结果提示,肿瘤细胞对雷帕霉素细胞增殖抑制作用的敏感性是与p27/KIP1的基础表达量相关,而非雷帕霉素对p27/KIP1的调控。此外,在p27/KIP1表达水平高的MCF-7细胞中,雷帕霉素可显著降低cyclinD蛋白表达,与cyclinD/CDK4的结合的p27/KIP1减少,而与cyclinE/CDK2复合物结合的p27/KIP1增加;但在雷帕霉素相对不敏感的MDA-MB-231细胞中,与CDK结合的p27/KIP1的量较少,可能与p27/KIP1的基础表达水平低相关。p27/KIP1蛋白水平在G1末期降低,以解除其对cyclinE/CDK2复合物的抑制一直被认为是细胞进入S期进程所必须的关键步骤。因此,我们推测p27/KIP1的表达只有达到一定的阈值才能阻滞G1/S演进:雷帕霉素敏感细胞中p27/KIP1表达量高于此阈值,在雷帕霉素导致cyclinD1下调的情况下引起G1期阻滞作用。 以上结果表明,雷帕霉素类抗肿瘤药物的体内外抗肿瘤活性与p27/KIP1表达水平呈高度正相关,提示p27/KIP1可作为雷帕霉素类药物疗效预测的候选生物标记物。 除p27/KIP1外,我们发现NCI 60株肿瘤细胞CXCL12基因表达水平与雷帕霉素的细胞增殖抑制活性也呈显著的正相关(r=0.40,p0.01)。CXCL12基因最早由日本学者克隆表达获得,并发现其与胃癌的转移密切相关,可单独作为胃癌的预后因子。胃癌在癌症相关死因中居第2位,癌细胞转移是进展期胃癌患者常见死因之一。因此,有效抑制胃癌转移侵袭的治疗策略,同早期诊断、早期治疗一样具有十分重要的意义。趋化因子CXCL12与其特异性受体CXCR4构成的CXCL12/CXCR4生物学轴在胃癌细胞转移过程中发挥重要作用,对这一功能轴的研究有望为胃癌转移防治找到新的突破口。初步的研究报道表明雷帕霉素能够抑制胃癌细胞迁移,但其具体作用机制还不清楚。我们以体外培养的胃癌细胞作为工具细胞,研究了mTOR信号通路在CXCL12/CXCR4介导的胃癌细胞迁移运动中所发挥的作用。 我们发现CXCL12刺激可激活胃癌MKN-45细胞中由PI3K介导的Akt/mTOR级联信号转导通路。同时,CXCR4拮抗剂AMD-3100、PI3K抑制剂PI-103、mTOR抑制剂雷帕霉素预处理细胞后,可在不同阶段拮抗CXCL12刺激引起的Akt或S6K1磷酸化水平上调,表明CXCL12可能是通过与膜受体CXCR4结合进而激活PI3K激酶、磷酸化Akt、激活mTOR从而上调磷酸化S6K1水平。此外,在CXCL12刺激下,稳定转染pEGFP-C1-Grp1-PH的CHO-K1细胞出现明显的膜皱褶现象,表明PIP3水平上升并募集含有PH域的蛋白到细胞膜上,证明CXCL12可直接激活PI3K激酶。 Ⅰ类PI3K激酶有四个p110催化亚基,细胞外信号分子可通过不同催化亚基激活PI3K。靶向PI3K亚基p110 beta基因的siRNA下调MKN-45细胞相关催化亚基表达水平后,CXCL12不能够再激活Akt及S6K1激酶。同时,p110 beta特异性抑制剂TGX-221能够取消CXCL12对MKN-45细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活。以上结果提示,CXCL12/CXCR4功能轴通过p110 beta亚基激活MKN-45细胞中PI3K通路。通过免疫共沉淀实验,我们发现CXCL12刺激可明显增加p110 beta与CXCR4的相互结合。上述结果阐明了CXCL12通过与胃癌细胞MKN-45膜受体CXCR4结合,促进CXCR4与PI3K催化亚基p110 beta相互作用来激活PI3K激酶活性,催化PIP2生成PIP3,进而磷酸化并激活Akt,活化下游的mTOR靶蛋白。 由于CXCL12与胃癌的转移高度相关,而我们发现CXCL12可激活胃癌细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路,因此我们推测PI3K/Akt/mTOR信号转导通路抑制剂可抑制CXCL12介导的胃癌细胞迁移。在单一因子CXCL12诱导条件下,PI-103和雷帕霉素对胃癌细胞MKN-45迁移的抑制率明显高于在血清诱导条件下药物对该细胞迁移的抑制率。进一步的研究表明mTOR抑制剂主要通过下调运动相关蛋白RhoA的表达,阻断F-actin的重组来实现抑制CXCL12诱导的胃癌MKN-45细胞迁移。同时,雷帕霉素也可以降低肿瘤细胞CXCL12趋化因子的分泌及其受体CXCR4的表达。 此外,我们发现nTOR靶向抑制剂雷帕霉素对CXCL12基因表达水平高的胃癌细胞株MKN-28、MKN-45细胞迁移的抑制作用也明显强于其对CXCL12表达水平相对较低的SGC-7901细胞迁移的抑制作用,提示mTOR抑制剂可用于预防或治疗CXCL12高表达的胃癌的转移。 综上所述,PI3K/mTOR信号通路在CXCL12/CXCR4介导细胞迁移中发挥重要作用,mTOR抑制剂能够抑制CXCL12诱导的细胞迁移;而且CXCL12表达水平高的胃癌细胞对mTOR抑制剂的细胞迁移抑制作用更为敏感。因此,我们推测靶向mTOR信号通路肿瘤治疗可用于CXCL12/CXCR4功能轴介导的胃癌转移。
【学位授予单位】:沈阳药科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R979.1

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