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三种调节昆虫免疫应答的新型serpin的分离纯化及生物学功能研究

姜睿  
【摘要】: 与人类的凝血途径和补体系统同理,许多昆虫的免疫应答由丝氨酸蛋白酶(serine protease, SP)级联介导,如黑化反应和Toll信号通路等。过度产生免疫应答会对宿主造成自身伤害,所以对激活免疫应答的上游信号进行精确调节至关重要。Serpin(serine protease inhibitor)是蛋白酶抑制因子中最大也是最重要的超家族,serpin使用自杀底物原理与靶酶形成稳定的共价复合物,导致靶酶失活。大量研究证实serpin参与脊椎动物中多种SP级联的活性调控,但对于serpin调节无脊椎动物的先天免疫应答的具体分子机理,我们仍然所知甚少,其原因主要是难以确定serpin的天然特异靶酶。 最近,本实验室报导了黄粉虫中的由三种SP组成的级联反应可以特异的激活Toll信号通路和黑色素合成。利用以上三种SP,我们从黄粉虫血淋巴中成功的检测到并纯化了三种新型的serpin,根据在SDS-PAGE胶上显示的分子量将它们分别命名为SPN40、SPN55和SPN48。 下一步我们克隆了新型serpin的cDNA序列,三种serpin的核苷酸序列在Genbank的登陆号分别是AB514563、AB514564和AB514565。这些serpin与Toll信号通路中的三种上游SP形成特异的复合物,如SPN40-MSP (Modular Serine Protease), SPN55-SAE(Spatzle-processing enzyme-Activating Enzyme)和SPN48-SPE (Spatzle-Processing Enzyme)三种配对。我们测定了靶酶在serpin的RCL(Reactive Center Loop)上的特异水解位点,出乎意料的是SPN55和SPN48分别在Tyr和Glu被特异水解,不符合它们的靶酶SAE和SPE的胰蛋白酶活性特点,这种现象归因于以上serpin使用外识别位点的机制增强自身的靶酶特异性。 在向黄粉虫中注射入Toll受体的天然配基Spatzle后,血淋巴中的SPN40和SPN55的含量大幅增加,说明了在Toll被激活后产生的细胞内信号能够诱导相关serpin的表达,大量的SPN40和SPN55以负反馈的机理从细胞进入血淋巴并阻断上游信号的传递。 体外活性重建实验证实了三种serpin可以共同阻断SP级联的信号传递,注射三种serpin混合物能够明显的抑制由β-1,3葡聚糖诱导的黑化反应并增加黄粉虫在黑化反应下的存活率。 综上所述,本研究发现并证实了三种新型serpin特异的调节昆虫的两种主要免疫应答Toll信号通路和黑化反应。在国际上对Toll信号通路的研究中首次阐明了完整的serpin-SP的配对关系,证实了本领域研究中对昆虫SP级联的每步反应都受到抑制因子精确调控的假想。


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