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《辽宁师范大学》 2010年
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海滨锦葵茎尖再生体系建立及GPD1和DGAT植物表达载体构建

刘野  
【摘要】: 为了提高海滨锦葵含油量,促进生物柴油产业发展,缓解能源危机给全球带来的压力,本实验以海滨锦葵茎尖为外植体,对海滨锦葵组织培养进行优化,建立了良好的高频的植株再生体系。并构建了高效的高含油量种子特异启动子napin驱动的GPD1和DGAT植物表达载体。为今后建立高频、高效海滨锦葵再生体系,利用转基因方法培育优良的、高含油量的海滨锦葵新品系提供一些参考数据。 以下为本研究主要进行的工作和取得的主要结论: 1.用98%的浓硫酸浸泡海滨锦葵种子1h左右,无菌水将表面浓硫酸冲洗干净,无菌水浸泡10h以上至种子露白,剥去种皮后接种到培养基上以获取无菌苗。取3日苗龄的无菌苗,用镊子和解剖刀将茎顶生长点除去,切取0.5~1.0mm茎尖分生组织接种到培养基上。培养温度为(26±1)℃;相对湿度为70%~80%;光照时间为14h/d;光照强度为2000lx。以MS(蔗糖3%、琼脂0.8%、pH值5.8)培养基为基本培养基。海滨锦葵茎尖萌发最适培养基为MS+IAA0.3mg/L+ZT0.3mg/L,萌发率为91.11%;增殖最适培养基为MS+IAA0.1mg/L+KT0.5mg/L,增殖系数为4.67;生根培养基为MS(蔗糖3%、琼脂0.6%、pH值5.8),生根率为90%。炼苗移栽后,成活率可达60%。 2.利用PCR扩增的技术从酵母INVSc1(Saccharomyces cerevisiae)、甘蓝型油菜(Brassica napus L.)的基因组DNA和拟南芥(Arabidopsis thaliana)cDNA中分别扩增获得3-磷酸甘油脱氢酶(GPD1)、种子特异启动子napin和二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT)的基因片段,并将它们分别克隆到pMD18-T(克隆载体)之中。利用pBluescriptKS(中间克隆载体)将napin和GPD1两目的基因片段插入到pCAMBIA1390(植物表达载体)的多克隆位点处,构建了种子特异启动子napin驱动的GPD1基因植物表达载体p1390NG。将napin和DGAT两目的基因片段依次插入到pCAMBIA1390(植物表达载体)的多克隆位点处,构建了种子特异启动子napin驱动的DGAT基因植物表达载体p1390ND,并分别利用冻融法将p1390NG和p1390ND两植物表达载体导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404、EHA105、AGL1中,本实验室正在进行抗逆能源植物海滨锦葵(Kosteletzkya virginica)和曼陀罗(Datura candida)种子含油量及油品的遗传改良方面的研究,本实验构建的载体为今后利用遗传操作技术提高油料能源植物的种子含油量提供了基础和材料,并且可以直接应用于曼陀罗和海滨锦葵的转基因分子育种,可应用于油料能源植物种子含油量的遗传改良。
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