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辽宁绒山羊绒相关LncRNA XLOC_005914的鉴定及对其靶基因表达的影响

倪萍  
【摘要】:辽宁绒山羊是我国禁止基因外流的宝贵资源品种,在国内辽宁绒山羊的单只产绒量居全国之首,具有较大的经济效益。从目前对辽宁绒山羊绒毛性状的研究情况来看,研究内容还主要集中在宏观的和较浅显的领域,特别是从绒毛生长相关长链非编码RNA角度研究其与靶基因的分子调控机理国内外还未见报道。因此本课题研究对加快培育产绒量高、绒细度细、绒毛质量上乘的辽宁绒山羊具有重要的理论基础和实践指导意义。我实验室在前期关于辽宁绒山羊的研究中,通过RNA-Seq测序技术、GO和KEGG等多种生信分析技术,筛选出了一条差异表达的信号通路—NF-κB信号通路,并在该通路中确定了与绒毛生长相关的差异表达的靶基因(IL8、NFKB2、TNFα、TNFAIP3和N FKBIA)所对应的差异表达的XLOC_005914,命名为LncRNA MTC。并发现褪黑激素处理皮肤细胞浓度为0.2 g/L、处理时间为72 h的条件是最有利于绒毛生长的。据此,我们对获得的LncRNA MTC进行定性实验,验证其不具有蛋白质编码功能,确实是一条非编码RNA;然后通过过表达慢病毒技术检测了LncRNA MTC在褪黑激素药物作用下对其靶基因表达的影响,以全新的视角初步揭示辽宁绒山羊绒毛生长相关LncRNA对靶基因的调控作用。本实验的主要研究结果如下:将LncRNA MTC序列输入NCBI网站查询其序列相关信息,在进行序列Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)后发现一高度重合序列,并且重合序列疑似为可编码蛋白的可变阅读框(Ovis aries musimon ri bose-phosphate pyrophosphokinase 1-like,66k D)。因此,我们构建了目的序列的原核表达载体(p ET28a–LncRNA MTC)和真核表达载体(p EGFP-C1-LncRNA MTC),将其转染至细胞后,均未发现融合蛋白的表达,证明LncRNA MTC不能编码蛋白质,是一条非编码的RNA。在LncRNA MTC过表达的皮肤细胞中检测LncRNA MTC靶基因表达水平,q PCR结果显示IL8、NFKB2、TNFα表达上调;TNFAIP3(A20)和NFKBI A(IKBα)表达下调。综上所诉,我们的研究证实前期课题组筛选鉴定出来的LncRNA MTC确实不具有蛋白质编码功能,既明晰了前期实验项目的准确性,同时也为继续非编码RNA在绒山羊绒毛生长发育中的作用研究奠定了坚实基础;而且LncRNA MTC能够调控其靶基因的表达,这也为深入研究辽宁绒山羊绒毛性状的调控机理提供了新的方法和思路。


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