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《辽宁师范大学》 2007年
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纤维素酶系协同作用实验及重组酵母的同步糖化发酵

张艳  
【摘要】: 将地球上最丰富且廉价的可再生生物质资源——纤维素材料转化为燃料乙醇,具有重要的经济和生态意义。利用天然纤维素材料生物转化乙醇时,纤维素糖化和乙醇发酵是目前两个重要的研究方向。本论文以提高纤维素糖化过程的酶解效率和乙醇产量为目的,针对纤维素酶活性不高、酶系缺陷导致的纤维二糖积累阻遏酶活发挥以及JU-A10同步糖化发酵体系缺失的问题,开展了以下三个方面的研究工作: (1)以酶制剂生产常用的木霉属菌株9414为目的菌株,利用实验室现有的15株真菌,进行了协同作用实验,试图发现促进纤维素酶活性发挥的蛋白辅助因子,提高纤维素的糖化效率。对9414的纤维素酶系具有正协同作用的菌株的β-葡萄糖苷酶活都比9414高,根据协同系数可初步推测促进作用是由β-葡萄糖苷酶引起的,验证了纤维素酶的酶系组成与其活性大小的密切关系。 (2)通过发酵温度、酵母接种量、底物浓度和酶液浓度的比较实验,对斜卧青霉JU-A10的同步糖化发酵系统进行了优化并建立了最佳的同步糖化发酵体系:10%木糖渣,20 IU/g酶浓度,0.2%酵母接种量,35℃静置培养。这组数据为燃料乙醇同步糖化发酵工艺的改进提供了重要的参考。 (3)在建立了酿酒酵母工业菌株转化系统的基础上,将纤维二糖代谢相关基因——扣囊复膜孢酵母编码的β-葡萄糖苷酶基因BGL1多拷贝整合到酵母工业菌株NAN-27的染色体上,并在转化子中筛选得到了具有较高β-葡萄糖苷酶活(1.02 IU/mg)的重组酵母NAN-227。利用纤维二糖发酵的结果显示,表达BGL1基因的重组酵母纤维二糖的乙醇转化率达到0.532 g/g,接近理论值0.538 g/g。利用工业发酵中常用的商品化纤维素酶制剂Celluclast 1.5 L和自己建立的斜卧青霉发酵系统进行的NAN-27和NAN-227的同步糖化发酵实验结果显示,重组酵母与宿主菌株相比,纤维二糖代谢能力提高,乙醇终浓度稍有提高,但与添加β-葡萄糖苷酶的对照组相比,发酵效果尚有差距。在酵母工业菌株中表达BGL1在一定程度上解除了同步糖化发酵体系中纤维二糖积累对纤维素酶活发挥的阻遏,可替代或减少乙醇工业生产时额外加入的β-葡萄糖苷酶量。
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