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《吉林大学》 2011年
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基质细胞衍生因子-1β对高脂诱导心肌细胞凋亡的预防作用及机制

赵宇光  
【摘要】:背景: 糖尿病能够引起机体多种组织器官损伤甚至功能衰竭。随着人们生活水平的提高,肥胖人群逐年增加,2型糖尿病的发病率逐年上升,其并发症糖尿病心肌病(DCM)日益受到重视。高脂能够诱导心肌细胞发生凋亡,而心肌细胞凋亡在DCM的发病机制中占有重要地位,然而,有关高脂诱导心肌细胞凋亡的具体机制目前尚未彻底阐明。 有关基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)的很多研究证明,SDF-1参与调节许多重要的生物过程,包括心脏和神经元发育、干细胞动员、血管新生、肿瘤发生及转移等。SDF-1调节这些迥异的生物进程是通过其经典的细胞表面特异性趋化因子受体4(CXCR4)实现的。但近年来研究发现,CXCR4并不是SDF-1在细胞表面的唯一受体,除CXCR4外还存在CXCR7,但CXCR7并不能广泛表达,其与CXCR4相比具有不同的生物学功能。 关于SDF-1对心脏系统的影响,既往研究主要集中于其动员干细胞至心脏损伤的部位,并通过血管新生修复心脏损伤,但SDF-1对脂毒性所致的心脏细胞损伤是否具有直接保护作用目前尚未有相关报道。 目的: 本研究在体外用饱和脂肪酸棕榈酸酯(palmitate,Pal)模拟2型糖尿病时机体内的高脂环境,来处理大鼠胚胎心肌细胞(H9c2),一方面拟阐明脂毒性诱导心肌细胞发生凋亡的机制;另一方面,探讨SDF-1β对高脂诱导的H9c2细胞凋亡是否具有保护作用,若具有保护作用,拟揭示其分子机制。 方法: 1. Pal诱导H9c2细胞凋亡及机制研究 (1)首先用Pal处理H9c2细胞,做剂量效应及时间效应实验,分别用western-blot检测cleaved-caspase3和细胞死亡ELISA试剂盒检测DNA链断裂来观察Pal诱导细胞的凋亡效应,从而选择出Pal诱导H9c2细胞凋亡的最适剂量及最佳处理时间。 (2)用western-blot的方法检测Pal诱导细胞凋亡不同信号通路上的关键蛋白(p-p53、p53、Bax、Bcl-2、AIF、GRP78、caspase12、CHOP and caspase8)进而确定Pal诱导H9c2心肌细胞凋亡的具体途径。 (3)用western-blot的方法检测3-NT,观察Pal能否引起H9c2细胞的硝化损伤。 (4)用western-blot的方法检测不同的阻滞剂或清除剂(apocynin、MnTMPyP、L-NAME、urate、4-PBA)对Pal诱导细胞硝化损伤、内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)及凋亡的影响,并明确硝化损伤、ERS及凋亡这三种现象之间是否有内在联系。 2. SDF-1β预防Pal诱导的心肌细胞凋亡及机制研究 (1)用western-blot检测cleaved-caspase3和细胞死亡ELISA试剂盒检测DNA链断裂,拟观察不同剂量的SDF-1β对Pal诱导的细胞凋亡是否具有预防保护作用,从中选择出具有保护作用的最适剂量进而做机制研究。 (2)用western-blot的方法观察不同的阻滞剂(PI3K阻滞剂:LY294002;ERK阻滞剂:U0126;p38 MAPK阻滞剂:SB203580;AMPK阻滞剂:compound C;SDF-1/CXCR4拮抗剂:AMD3100)和siRNA(p38βMAPK siRNA、CXCR7 siRNA、IL-6 siRNA)能否阻滞SDF-1β对心肌细胞的预防保护作用;再用激动剂(AMPK激动剂:AICAR)或重组IL-6观察是否同样能够起到预防心肌细胞凋亡的作用。进而分析具体哪条信号转导通路参与SDF-1β保护Pal诱导心肌细胞凋亡的过程。 结果: 1. Pal诱导H9c2细胞凋亡的最佳剂量和时间点分别是62.5μM和15 h。 2.经Pal处理后,H9c2细胞的GRP78、caspase12、CHOP表达升高,而Bax/Bcl-2比值、p-p53/p53比值、AIF和caspase8表达没有发生变化,说明Pal不通过线粒体途径和死亡受体途径、而通过ERS途径引起细胞凋亡。 3. Pal能够使3-NT表达升高,说明Pal能够引起心肌细胞硝化损伤。 4.用不同阻滞剂或清除剂分别阻断硝化损伤或ERS这部分实验证实Pal诱导的H9c2细胞硝化损伤和ERS均发生于凋亡之前,且ERS的发生是硝化损伤途径依赖性的。 5. SDF-1β的剂量效应实验证明其在100 nM时能够显著抑制Pal诱导的心肌细胞凋亡。 6. SDF-1β预防Pal诱导心肌细胞凋亡的作用是通过激活p38 MAPK实现的,用p38阻滞剂SB203580能够完全阻断SDF-1β的心肌保护作用。p38βsiRNA同样能够完全抑制SDF-1β的心肌保护作用,进而说明SDF-1β预防心肌细胞凋亡的作用是通过激活p38β亚型实现的。 7. SDF-1β的心肌保护作用是通过激活AMPK实现的,SDF-1β激活p38 MAPK的作用是AMPK依赖性的,AMPK阻滞剂compound C能够阻断SDF-1β的保护作用,而AMPK激动剂AICAR同SDF-1β一样,能够预防Pal引起的心肌细胞凋亡。 8. SDF-1β能够促进H9c2细胞分泌IL-6进而保护Pal诱导的细胞凋亡,这种效应是通过激活AMPK及p38 MAPK实现的。 9. IL-6 siRNA能够阻断SDF-1β的心肌保护作用,而重组IL-6能够预防Pal诱导的H9c2细胞凋亡。 10. H9c2细胞表面存在CXCR7受体,SDF-1β保护Pal诱导心肌细胞凋亡的作用不是通过其细胞表面受体CXCR4、而是通过CXCR7实现的。这种效应能够被CXCR7 siRNA所阻断,同时,CXCR7 siRNA还能够阻断SDF-1β对AMPK及p38 MAPK的激活作用。 结论: 1. Pal引起H9c2细胞凋亡是通过诱导细胞硝化损伤和ERS实现的;凋亡的发生是ERS依赖性的,而ERS的发生是硝化损伤依赖性的。 2. SDF-1β能够预防Pal引起的心肌细胞硝化损伤、ERS和凋亡。 3. SDF-1β的心肌保护作用是通过与细胞表面受体CXCR7结合,进而激活AMPK和p38 MAPK,促进IL-6生成来实现的。 创新点: 1.阐明Pal诱导心肌细胞凋亡的分子机制,即Pal通过诱导细胞硝化损伤和ERS进而引起心肌细胞凋亡。 2.证明SDF-1β对Pal诱导的心肌细胞凋亡具有保护作用。 3.证明H9c2细胞表面有CXCR7表达。 4.阐明SDF-1β预防Pal诱导心肌细胞凋亡的分子机制,即通过与CXCR7结合,进而激活AMPK和p38 MAPK,促进IL-6生成来实现的。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R587.1

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【参考文献】
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【共引文献】
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