蒺藜皂苷单体B对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

【摘要】：血栓性疾病会导致心肌缺血、心功能下降、细胞形态改变、死亡,最终导致心力衰竭的发生。临床上常采用血栓溶解、经皮冠状动脉介入治疗或非体外循环冠状动脉旁路移植术等,恢复缺血区血液灌注。然而,再灌注恢复缺血区血流常会导致比单纯缺血更严重的损伤,称为缺血再灌注损伤。在急性冠脉综合征中,缺血再灌注损伤是一个常见的病理过程。治疗心肌缺血再灌注损伤的有效方法是缺血预适应,但在临床上常难以做到,因此寻找有效药物仍是治疗心肌缺血的关键。 蒺藜皂苷(gross saponins of Tribulus terrestris,GSTT)是从蒺藜科植物蒺藜干燥成熟果实中提取的有效组分之一,是以甾体皂苷为主的总皂苷,主要包括呋甾醇和螺甾醇两类皂苷。研究表明,蒺藜皂苷具有降低血压、舒张血管、降低胆固醇、抗动脉粥样硬化、保护大鼠心肌缺血、保护大鼠脑缺血、改善微循环、抗衰老、降血糖和明目等作用。近年来,本实验室对蒺藜皂苷的药理作用及机制进行了研究,证实蒺藜皂苷对心脑缺血再灌注损伤均具有保护作用。但其确切的物质基础至今未明。 与吉林大学化学学院合作,从蒺藜皂苷中分离提取出九种蒺藜皂苷单体,对其活性进行筛选,初步确定具有心肌保护作用的蒺藜皂苷单体(Tribulus terrestris saponin monomer,TTSM),并对其作用机制进行了研究。 本研究分为三个部分,先以总皂苷进行研究,确定最佳用药剂量,并以此做为单体研究中的阳性对照药。 1、蒺藜皂苷对阿霉素损伤心肌细胞的保护作用 观察蒺藜皂苷(GSTT)对阿霉素(Adriamycin,ADR)诱导大鼠乳鼠心肌细胞损伤的保护作用,确定GSTT抗心肌缺血的有效剂量。分离出生1~3 d大鼠心肌细胞,培养72 h后随机分为正常对照组、ADR(终浓度为2.0 mg·L-1)损伤组和GSTT 100、30、10 mg·L-1组,继续培养24 h后,应用MTT比色法检测细胞存活率,测定培养基中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)释放量,超氧化物歧化酶(SOD)活性,丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量,并采用流式细胞仪检测细胞凋亡及应用western blotting检测GSTT对Caspase-3的作用。 结果表明,与对照组比较,ADR组心肌细胞存活数明显减少,心肌细胞培养液中CK、LDH、AST释放量增加(P0.001),同时SOD活力下降而MDA、NO含量升高(P0.001);与模型组比较,GSTT 100、30 mg·L-1组存活心肌细胞数增多(P0.05,P0.01),心肌细胞培养液中CK、LDH、AST含量明显降低,SOD活力增加、MDA和NO含量降低(P0.05,P0.01)。流式细胞仪检测GSTT 100、30 mg·L-1组心肌细胞凋亡数明显减少,Caspase-3表达下降(P0.01)。 GSTT可对抗自由基,减轻ADR对心肌细胞的损伤,抑制心肌细胞凋亡,其中在剂量为100 mg·L-1时作用较为显著。 2、蒺藜皂苷单体的活性筛选 九种蒺藜皂苷单体,分别命名为JA, JB, JC, JD, JE, JF, JG, JH和JI。采用H2O2与心肌细胞培养5h,诱导心肌氧化应激损伤,以MTT法检测细胞存活率,筛选有心肌保护作用的单体。结果确定JB(替告皂苷元-3-O-β-D-吡喃木糖-(1→2)-[β-D-吡喃木糖-(1→3)] -β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)] -β-D-吡喃半乳糖苷,TTSMB)在剂量10-9~10-7mol·L-1具有活性,JG(海柯皂苷元3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D -吡喃半乳糖苷)在10-9~10-6mol·L-1具有活性。JB易得,收率较高,因此以JB进行研究。 3、蒺藜皂苷单体B对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用 (1)蒺藜皂苷单体B对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用 70只大鼠随机分为7组,正常对照组(Control)、缺血/再灌注损伤组(I/R)、蒺蒺皂苷(GSTT)组、蒺蒺皂苷单体B(TTSMB)100、10、1 nmol?L-1组、Che+TTSMB+I/R组,缺血30 min,再灌120 min。采用TTC法测量心肌缺血面积,检测心脏灌流液中肌酸肌酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬酸氨基转移酶(AST)含量,心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)水平。心肌组织切片,镜下观察病理形态学变化,采用TUNEL染色计数心肌细胞凋亡率。Western blotting检测心肌组织中Bax及Bcl-2、Caspase-3、PKCε表达,免疫组织化学染色检测磷酸化PKCε表达。 结果显示,TTSMB 100、10、1 nmol?L-1可缩小心肌梗死面积,减少心肌细胞中CK、LDH、AST的漏出,提高心肌组织SOD活性,降低MDA含量,减轻心肌组织的病理损害,降低心肌细胞凋亡率(P0.01,P0.001)。TTSMB能减少Bax、Caspase-3蛋白表达,增加Bcl-2、PKCε表达。应用PKC抑制剂Cherrythine可抑制TTSMB的心肌保护作用。 (2)TTSMB对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用 分离出生1~3 d大鼠心肌细胞,培养72 h后随机分为正常对照组(Control)、缺氧复氧模型组(H/R)、蒺藜皂苷组(GSTT)、蒺藜皂苷单体(TTSMB )10、1、0.1 nmol·L-1组,缺氧3 h,复氧2 h,体外模拟心肌缺血再灌注损伤。观察细胞形态学变化,应用MTT比色法检测细胞存活率,测定培养基中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)释放量,超氧化物歧化酶(SOD)活性,丙二醛(MDA)含量,并采用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率,应用western blotting检测Caspase-3表达。 结果显示,与对照组比较,H/R组心肌细胞形态发生变化,存活细胞数明显减少,心肌细胞培养液中CK、LDH、AST释放量增加(P0.01,P0.001),SOD活力下降,MDA含量升高(P0.01,P0.001);与模型组比较,应用TTSMB后,存活心肌细胞数明显增多(P0.05,P0.01),心肌细胞培养液中CK、LDH、AST含量降低,SOD活力增加、MDA含量降低(P0.05,P0.01),心肌细胞凋亡率明显下降,Caspase-3表达亦下降。 TTSMB可对抗自由基,减轻心肌细胞缺氧复氧损伤,抑制心肌细胞凋亡。(3)TTSMB抗缺氧复氧损伤的机制研究 研究中发现TTSMB对大鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用,离体实验发现其能激活PKCε,为进一步检测TTSMB是否通过PKCε通路起到心肌保护作用,采用体外培养心肌细胞缺氧复氧损伤模型,并应用特异性PKCε抑制剂及ERK1/2抑制剂,检测单体B对PKCε及ERK1/2的作用,探讨其作用机制。 分离出生1~3 d大鼠心肌细胞,培养72 h后随机分为7组,正常对照组(Control)、缺氧复氧损伤组(H/R)、TTSMB 10 nmol?L-1组、PKCε抑制剂+TTSMB+H/R组、PD98059+TTSMB+H/R组、PKCε抑制剂+H/R组、PD98059+H/R组,缺氧3 h,复氧2 h。应用MTT比色法检测细胞存活率,测定培养基AST释放量、MDA含量,并采用流式细胞仪检测细胞凋亡,激光共聚焦及免疫组织化学染色检测PKCε及ERK1/2表达,同时采用Western blotting检测心肌组织中PKCε及ERK1/2的表达。结果与模型组比较,应用PKCε特异性抑制剂后,ERK1/2表达下降,部分抵消了TTSMB的心肌细胞保护作用,而应用ERK1/2抑制剂对PKCε表达无明显影响。由此得出结论,TTSMB对心肌细胞的缺氧复氧损伤的保护作用与其激活PKCε/ERK1/2通路,从而启动心肌细胞保护作用有关。 综上所述,单体B(化学名为替告皂苷元-3-O-β-D-吡喃木糖-(1→2)-[β-D-吡喃木糖-(1→3)] -β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)] -β-D-吡喃半乳糖苷,tribulosin)是蒺藜皂苷的有效成份之一,能对抗自由基损伤,抑制心肌细胞凋亡,对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,其机制可能是通过激活PKCε/ERK1/2通路,从而抑制凋亡基因的表达而实现的。