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《吉林大学》 2011年
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抗羊布氏杆菌病转基因细胞系的构建及相关问题的研究

关继羽  
【摘要】:由布氏杆菌引发的布鲁氏病是一种重要的人兽共患性疾病,可以引发波浪热、使雌性动物流产。因此,防治布病对家畜养殖及公共卫生均具有重要的意义。然而,布氏杆菌对宿主的侵染机制及致病机制目前尚不完全明确。迄今为止,还没有疫苗或药物能够完全防治本病,故尝试采取积极有效的措施进行选种选育工作,以期使得羊等家畜具有对布氏杆菌的抵抗力。转基因动物的研究已经有了长足的进步,特别是自1997年多莉羊出生以来,克隆技术在该领域的应用备受关注。各种转基因克隆动物相继出生,特别是转基因克隆牛、猪、羊的出生为大量培育品质优良的家畜品种奠定了基础。同时也为培育具有抵抗布鲁氏病的转基因克隆羊提供了可能性。本研究旨在根据布氏杆菌致病机理的最新研究进展,通过克隆、筛选抗病基因、构建表达嵌合蛋白的转基因细胞系,为培育抗布鲁氏病转基因克隆羊提供实验依据。目前得到的实验结果为:(1)成功克隆了羊A类清道夫受体SR-A的胞外段cDNA序列SR-A ectodomain,拼接成功羊源防卫素β-defensin,化学合成人工设计的抗菌肽V13KL;将β-defensin与SR-A ectodomain拼接合成嵌合基因;将两种抗菌肽cDNA克隆到真核表达载体pIRES_2-EGFP中,获得重组质粒。将嵌合基因defensin-SR-Aectodomain克隆到真核表达载体pcDNA3.1及pEF1α-GFP中,获得重组质粒。(2)将该两种抗菌肽的真核表达载体瞬时转染COS-7细胞,通过流式细胞仪检测对细胞的生理状态的影响。结果表明,表达抗菌肽的转染组的凋亡率显著低于未转染的对照组及转染空质粒的对照组;同时,表达β-defensin的转染组的凋亡率低于V13KL的转染组,但差异不显著;表达β-defensin的重组质粒对小鼠受精卵的原核注射后,胚胎发育状态良好,囊胚发育率及GFP阳性率与空质粒对照组无显著差异,表明抗菌肽β-defensin对早期胚胎的发育没有毒害作用。(3)将重组质粒pEF1α-defensin-SR-A ectodomain-GFP转染COS-7细胞后,提取细胞总蛋白,进行Western Blot实验,结果表明嵌合肽可以在真核细胞中高效表达;用线性化的重组质粒pcDNA3.1-defensin-SR-A ectodomain进行细胞稳定转染、筛选,14天后开始出现较为明显的细胞克隆,挑取克隆后对其进行基因组及RNA的提取,成功检测了目的基因、抗性基因的整合,同时也检测到了目的嵌合基因的转录。总之,本研究获得了稳定表达嵌合肽的转基因细胞系,为后续抗布氏杆菌病转基因克隆羊的培育奠定了坚实基础。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S855.12

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