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《吉林大学》 2011年
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狂犬病病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒的研制与应用

许运斌  
【摘要】:本研究通过对GenBank公布的31株基因型1型狂犬病病毒(RV)N基因全序列进行同源性比较分析,选取序列中保守的区域设计了一对引物和一条Taqman探针,优化了反应体系和条件,建立了可特异针对RV的一步法荧光定量RT-PCR检测方法(qRT-PCR).在此基础上,设计了狂犬病病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒生产工艺,组装并成功研制了狂犬病病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒。该检测方法能够特异检测RV,尤其能够特异检测我国狂犬病流行毒株,所采用的引物和探针经BLAST发现与GenBank公布的我国狂犬病流行毒株相应序列完全匹配,只与少数毒株有个别碱基错配,不会影响检测结果。特异性试验证明该检测方法能特异检测基因Ⅰ型狂犬病病毒,而对狂犬病病毒属其他6个基因型病毒和5种导致动物脑炎疾病常见的病原体(犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬腺病病毒(CAV)、水泡性口炎病毒(VSV)、日本乙型脑炎病毒(JEV))不会产生检测信号。稳定性试验表明,5个重复样品Ct值的变异系数均小于5%,证明该方法在细胞毒和脑组织毒检测方面稳定性较好。敏感性试验证明了该检测方法可检测出处于不同进化群的3株疫苗毒株以及分布于我国不同地域处于不同进化支的7株流行街毒株,由此表明该方法可检测我国广大地区的狂犬病病毒。用已知病毒滴度的狂犬病病毒BHK-21 SRV9细胞毒提取总RNA,10倍稀释后制备了标准品,该标准品可以用于准确定量临床样品中狂犬病病毒滴度,以该标准品进行荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度试验,表明该方法可稳定地检测出4.68TCID50的病毒含量,与国家农业行业狂犬病标准检测技术套式RT-PCR灵敏度相当,建立的Ct值与模板起始浓度对数之间的线性关系良好,相关系数为r=0.999,斜率为-3.495,表达式:Ct=-3.495 log 10TCID50+33.29。在qRT-PCR方法建立之后,通过对34份临床狂犬病发病犬脑组织样品进行荧光抗体实验(FAT)、鼠脑内接种实验(MIT)、套式RT-PCR、qRT-PCR检测,结果表明所建立的qRT-PCR方法与套式RT-PCR灵敏度相当,比FAT和MIT敏感,而且适合于腐败样品检测。 按照所设计的狂犬病病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒生产工艺,分别采用分三次合成、经相应检验合格的引物和探针及其他试剂按优化后反应体系的要求配制了三批狂犬病病毒荧光定量RT-PCR检测试剂,并进行试剂盒的组装,编号为2009001、2009002、2009003,进行可重复性试验和为期12个月的保存期试验,综合评价了该试剂盒的灵敏度和特异性等指标,成功研制了特异、灵敏、快速的狂犬病病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒。 为了将所研制的试剂盒应用于疫苗毒株全程生产质量监控以及街毒株细胞适应性研究,采用该技术对实验室候选疫苗毒株BHK-21 SRV9细胞毒以及狂犬病组织培养分离实验(RTCIT) N2A细胞分离的毒株貉、WS、FJ02细胞毒F1-F8代进行定量试验,并与半数细胞感染量(TCID50)试验测定的病毒滴度进行比较。结果显示各细胞毒定量结果与TCID50测定试验结果相差在10个TCID50/100μl以内。由此表明,试剂盒的定量试验可替代TCID50测定方法对各种疫苗进行质量监控以及对街毒株的细胞适应性进行研究。 采用研制的试剂盒进行人工腐败性脑组织样品的检测,结果表明试剂盒与套式RT-PCR均能灵敏地检测到腐败17天后的脑组织,灵敏度比FAT、MIT要高:试剂盒对1994份临床犬脑组织样品检测也同样发现,在新鲜样品检测方面,试剂盒与FAT和MIT符合率为100%,而在检测过程中FAT未检出的1份样品和MIT未检出的2份样品均为送检时已腐败的狂犬病临床发病犬脑组织。由此表明,无论是人工模拟腐败的样品检测还是临床送检腐败的样品检测,试剂盒检测的准确性均达到了FAT和MIT的水平,而且灵敏度更高,更适合于腐败样品的检测。试剂盒对人工感染狂犬病病毒株小鼠的检测试验表明,试剂盒能在小鼠出现临床症状前更早地检测到狂犬病病毒,在狂犬病早期检测中比FAT和MIT也都要灵敏;对2950份流行病学监测犬唾液样品、8份狂犬病病毒感染的动物唾液样品进行检测,结果2950份流行病学监测犬唾液样品中4份唾液呈检测阳性,阳性率为0.14%,试剂盒与套式RT-PCR符合率达100%,8份狂犬病病毒感染的动物唾液样品中3份羊唾液呈检测阳性,而套式RT-PCR只检出2份阳性唾液。由此证明了试剂盒灵敏度与套式RT-PCR相当,达到了动物狂犬病唾液流行病学监测和检测的要求。 此外,在国际实验室比对样品检测中,该试剂盒所检测出的基因1型狂犬病病毒样品与本室建立的基因分型DNA芯片、套式RT-PCR、SYBR Green通用型荧光定量RT-PCR及FAT检测结果完全相符。由此进一步证明我们研制的狂犬病病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒具有良好的敏感性、特异性和可重复性。 通过对狂犬病病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒各指标性能的评价以及对大量临床样品的检测,获得了大量令人满意的试剂盒临床前及临床试验数据,表明该试剂盒在我国动物狂犬病监测和检测中具有巨大的应用价值,为试剂盒商品化及其在基层的推广使用提供可靠的数据支持。另外,随着全自动化技术的不断发展及其推广应用,试剂盒已结合全自动样品研磨设备以及全自动核酸提取系统用于高通量样品的筛查,可实现日检测千份样品的能力。该试剂盒不仅适合单个样品的狂犬病确诊,而且还适合动物狂犬病大规模的流行病学监测和检测,将为我国动物狂犬病的消除和控制提供强有力的技术保障。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S855.3

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