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《吉林大学》 2011年
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侧链氢键对嗜热酯酶APE1547及其推进器结构域稳定性的影响

徐军  
【摘要】:超嗜热酶与其同源的嗜温酶非常相似,它们的序列同源性很高,一般在40~85%;三维结构重叠,并且具有相同的催化机制。但超嗜热酶有诸多的结构特点使它在110℃高温下仍能保持高稳定性和最佳活性。影响酶热稳定性的因素有很多,象氢键,疏水相互作用,离子对,静电作用,二硫键等等,但是并不是单一的一种作用完全决定一个酶的热稳定性。研究这些因素在酶结构和稳定性中的作用机制,不仅能更好地改造常温酶的稳定性,以适应工业生产中较苛刻的环境,还可将嗜热酶作为模型研究酶的进化。 超嗜热酯酶APE1547来源于嗜热泉古菌Aeropyrum pernix K1,属于脯氨酰寡肽酶家族(Prolyl oligopeptidase, POP)。APE1547编码582个氨基酸,同时具有酯酶和肽酶活性,是一个双功能酶。它由两个结构域组成,N-端为一个β-推进器结构域,C-端为一个规则的α/β水解结构域。β-推进器结构域的三级结构高度保守,不同酶之间的一级序列同源性很低。β-推进器结构域主要起稳定全酶的作用。 本论文以APE1547的β-推进器结构域中的侧链氢键为研究对象,选择不同叶片间的氢键进行突变,研究特殊位置的氢键对酶稳定性的影响。这几对氢键分别是位于1-7“叶片”间的Asp52-Arg292;5-6“叶片”间的Thr209-Tyr253;4-5“叶片”间的Arg160-Ile202,Asp158-Ile202。将成键氨基酸之一进行突变,得到三个突变体酯酶:R292L,Y253L和R160L/D158V。 首先,对野生型和突变体酯酶的基本酶学性质进行了研究。突变体酶的最适反应温度是92.5℃,比野生型酶的最适温度低2.5℃。野生型和突变体酶的热稳定性主要通过热失活的半衰期和热失活的自由能变两方面来检测。在85℃下测各酯酶突变体的热失活曲线呈一级失活过程。突变体酯酶R292L,Y253L和R160L/D158V的半衰期分别为12.9h,12.24h和11.61h,与野生型APE1547的15.26h相比分别降低了2.36h,3.02h和3.65h,说明叶片间氢键的缺失突变造成了酶的热稳定性降低。其中由R160L/D158V双突变体引起的酶稳定性降低最为明显。 动力学分析显示,各突变体的Km值与野生型相比几乎没有变化,说明酶与底物的亲和力没有发生明显的改变。但各突变体的kcat值均比野生型高,说明底物的转化速率明显增加。 用盐酸胍变性来研究突变后酯酶对化学变性剂的稳定性,野生型和突变体酶先发生酶活性的丧失,结构随后发生变化。2M的盐酸胍就使酶失去了90%的活性,此时酶还能保持大部分的结构稳定。但突变体酶的活性和结构变化都比野生型快,其顺序是:双点突变体R160L/D158V的变化最快,单点突变体Y253L次之,R292L则接近于野生型酯酶,是由于,Arg292位于第七叶片的loop上,而Tyr253、Arg160和Asp158则位于叶片的主要部分β-片层中,去除推进器结构域叶片之间的氢键,减弱叶片间的相互作用,结构更加松散,故稳定性减低,而酶活却提高了。 为了进一步验证氢键对APE1547的稳定作用,将氢键所在的β-推进器结构域单独克隆并表达出来。β-推进器结构域的作用主要是稳定整个酶分子,叶片间的打开是否是底物接近活性位点的前提。因推进器结构域没有活性,故只能从稳定性方面进性研究。用荧光光谱测定野生型和突变体推进器热稳定性和化学稳定性。野生型推进器结构域蛋白非常稳定,在热变性和盐酸胍诱导变性中均显示结构更加紧密,而各突变体酶的推进器部分则在同样的变性条件中结构更加松散,其中以双突变体R160L/D158V的结构变化最大。通过对该结构域稳定性和盐酸胍变性实验的比较发现,APE1547的推进器结构域对热更敏感,对化学变性剂盐酸胍的抗性较强。 本文以APE1547的β-推进器结构域中的几对氢键为研究对象。通过氨基酸替换,获得了R292L,Y253L和R160L/D158V这三个突变体。通过酶学基本性质、结构和稳定性分析,证明侧链氢键对维持APE1547的稳定性有重要作用。同时,将野生型和各突变体酶的β-推进器结构域单独克隆出来,并实现可溶表达,对推进器结构域的结构和稳定性进行分析。进一步证明氢键对推进器结构域稳定性的影响,为提高酶活和常温酶分子的改造提供理论依据。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q55

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