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《吉林大学》 2011年
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TET癌基因家族成员2(TET2)N末端的表达及其多克隆和单克隆抗体的制备

孙莹  
【摘要】:2009年3月,骨髓增生性肿瘤(myeloproliferative neoplasms, MPNs)患者体内TET2(Ten-Eleven Translocation 2)突变的发现,使得对包括MPNs在内的髓系恶性肿瘤的研究再次成为血液疾病研究领域的热点。TET2作为一种抑癌基因,其缺失或者突变会引起骨髓细胞的恶性增生。目前,对TET2的研究还都局限在基因水平上,至于TET2如何发挥抑癌功能,我们尚不知晓。由于TET2与多种恶性肿瘤相关且其突变具有多样性,因此,制备TET2蛋白的抗体对于研究TET2蛋白的功能以及在突变水平检测TET2突变具有重要的意义。 经用软件对TET2蛋白N端优势抗原表位分析,本研究设计一对引物克隆TET2 N末端抗原性较好的抗原编码基因,命名为TET2N,并克隆到载体pBluescript II KS(pKS)质粒中,经酶切及测序鉴定正确后分别构建pGEX-TET2N和pMAL-TET2N表达质粒,然后转化到E. coli Rosetta DE3 pLysS中高效表达,并通过亲和层析等技术,提取纯化了两种TET2融合蛋白—GST-TET2N和MBP-TET2N,分子量分别约为46kDa和63kDa。其中,GST-TET2N作为抗原免疫动物,制备Anti-TET2N多抗及单抗;融合蛋白MBP-TET2N则用于多抗纯化和单抗杂交瘤细胞筛选。 多克隆抗体的制备:以GST-TET2N作为抗原对新西兰白兔进行免疫,获得了Anti-TET2N的多克隆抗体,其灵敏度高达10-1ng,并利用正、负亲和层析的方法对抗体进行了纯化(融合蛋白MBP-TET2N用于正选择亲和层析以筛选抗体),纯化后的抗体可以有效识别HepG2细胞中所含有的TET2蛋白,制备Anti-TET2N的多克隆抗体的目的是为了进一步验证Anti-TET2N单克隆抗体的鉴定结果,以便多方面更好的分析抗体检测结果。 单克隆抗体的制备:以GST-TET2N为抗原对BALB/c小鼠进行免疫,用另一种融合蛋白MBP-TET2N进行抗体筛选,获得了Anti-TET2N的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies,MAb),其效价达到8:10~4,获得的抗体可以识别HepG2细胞中的TET2蛋白。该MAb的成功制备将为进一步建立利用MAb在蛋白水平上检测TET2突变的诊断方法及分析TET2蛋白的生理生化功能等方面的研究奠定基础。
【学位授予单位】:吉林大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R733.3

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