狂犬病病毒糖蛋白基因重组慢病毒载体的构建及免疫试验

【摘要】：狂犬病病毒属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)中的狂犬病毒属(Lyssavirus)。狂犬病毒颗粒外形呈现子弹状,长约170纳米左右,直径为75nm。狂犬病病毒基因组为单股负链RNA病毒,其完整病毒颗粒包括五种结构蛋白(核蛋白,磷酸蛋白,基质蛋白,糖蛋白,L蛋白)和一分子的RNA构成。 狂犬病(Rabies)是由狂犬病毒(Rabies virus)引起的,一种侵害中枢神经系统的感染性疾病,狂犬病病毒主要通过破损的皮肤或粘膜侵入体内,经神经末梢进入中枢神经系统,临床主要表现为行为反常,狂躁不安,进行性麻痹,最终死亡等特征。感染对象为温血动物和人,是一种死亡率几乎为100%的人兽共患病疾病。 目前人狂犬病的传播和贮存宿主以犬为主,且病例绝大部分集中在发展中国家。全世界每年有50000～55000人死于狂犬病,我国每年就有3000人死于狂犬病。其中95%以上的人狂犬病是由于带毒的犬感染引起的。带毒动物的咬伤是狂犬病传播的主要途径,狂犬病已经有三千年历史,世界上80多个国家仍有发生,尤其是在亚洲和非洲,狂犬病的发病率和死亡率超过其它类型的传染病, 给犬接种有效疫苗是预防人和动物狂犬病的最好办法,研发一种免疫效力高、免疫周期长的狂犬病疫苗对预防和控制狂犬病具有重要意义。令人欣慰的是,安全并且高效的商业细胞培养疫苗,能够很好的预防和控制狂犬病。然而在发展中国家,由于生产疫苗需要费用较高；暴露后免疫治疗需要多次免疫。这种纯化的细胞培养疫苗未能得到实际应用。发展中国家迫切需免疫效果好且廉价的疫苗,一次免疫就能达到免疫保护。基因重组技术和反向遗传技术研制的新型狂犬病疫苗、基因工程疫苗,可以通过细胞系统扩大培养,但其免疫原性较弱；DNA疫苗较容易扩大培养,但是这些疫苗与亚单位疫苗的抗原表达量较低,没有得到理想应用；其它新型疫苗,包括基因重组疫苗(痘病毒载体疫苗和腺病毒载体疫苗)现在仍然在审查中。因此研制免疫效力高,廉价的狂犬病疫苗,是狂犬病疫苗急待解决的问题。 本次试验使用的以HIV-1型为基础的慢病毒载体,能够携带外援基因容量大,可以感染分裂细胞和非分裂细胞,可以整合到靶基因组上,能够在靶细胞中稳定和长期表达,并且删除病毒复制的必须基因,安全性较好,免疫排斥小,不会引起免疫排斥反应。 本试验参考GeneBank中狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因序列,合成一对特异性引物,通过RT-PCR反应,获得狂犬病病毒糖蛋白基因,狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因连接至T载体,经测序正确后,使用限制性内切酶EcoR V和BamHⅠ双酶切,并回收狂犬病糖蛋白基因；首先将慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen用EcoKⅠ酶切作用1h后,加入0.5μl Klenow和1μl dNTP Mixture作用30min,将5′端补平,通过凝胶回收试剂盒回收片段,再将回收片段用BamHⅠ单酶切,再次回收载体片段作为连接用载体；然后将糖蛋白基因与制备的载体按9：1的比例用T4连接酶16℃连接12h,构建表达载体pLVX-IRES-ZsGreen -SRV9G;将构建的含有糖蛋白基因的重组表达载体与包膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2共转染293T包装细胞,通过荧光显微镜观察报告基因(ZsGreen)表达情况,收集上清,经浓缩后接种293T细胞,得到重组慢病毒感染细胞,经RT-PCR反应检测外援基因能够在感染细胞内转录。 重组病毒肌肉注射免疫小鼠的免疫试验,经Western blot检测表明,重组病毒可以刺激机体,产生抗狂犬病糖蛋白的特异性抗体。经过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)表明,经过免疫2周后,可以检测到抗狂犬病中和抗体,第3周后,产生的抗狂犬病中和抗体的达到最高,且高于0.5IU/ml (疫苗最低保护单位)。 本试验获得表达狂犬病病毒糖蛋白的重组病毒pLVX-IRES-ZsGreen-SRV9G,对获得的重组病毒进行生物学和免疫学验证。该重组病毒可以通过肌肉注射免疫小鼠,能够刺激机体产生抗狂犬病中和抗体。本研究对研制狂犬病病毒重组疫苗奠定了基础。