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狂犬病病毒糖蛋白基因重组慢病毒载体的构建及免疫试验

房丽君  
【摘要】:狂犬病病毒属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)中的狂犬病毒属(Lyssavirus)。狂犬病毒颗粒外形呈现子弹状,长约170纳米左右,直径为75nm。狂犬病病毒基因组为单股负链RNA病毒,其完整病毒颗粒包括五种结构蛋白(核蛋白,磷酸蛋白,基质蛋白,糖蛋白,L蛋白)和一分子的RNA构成。 狂犬病(Rabies)是由狂犬病毒(Rabies virus)引起的,一种侵害中枢神经系统的感染性疾病,狂犬病病毒主要通过破损的皮肤或粘膜侵入体内,经神经末梢进入中枢神经系统,临床主要表现为行为反常,狂躁不安,进行性麻痹,最终死亡等特征。感染对象为温血动物和人,是一种死亡率几乎为100%的人兽共患病疾病。 目前人狂犬病的传播和贮存宿主以犬为主,且病例绝大部分集中在发展中国家。全世界每年有50000~55000人死于狂犬病,我国每年就有3000人死于狂犬病。其中95%以上的人狂犬病是由于带毒的犬感染引起的。带毒动物的咬伤是狂犬病传播的主要途径,狂犬病已经有三千年历史,世界上80多个国家仍有发生,尤其是在亚洲和非洲,狂犬病的发病率和死亡率超过其它类型的传染病, 给犬接种有效疫苗是预防人和动物狂犬病的最好办法,研发一种免疫效力高、免疫周期长的狂犬病疫苗对预防和控制狂犬病具有重要意义。令人欣慰的是,安全并且高效的商业细胞培养疫苗,能够很好的预防和控制狂犬病。然而在发展中国家,由于生产疫苗需要费用较高;暴露后免疫治疗需要多次免疫。这种纯化的细胞培养疫苗未能得到实际应用。发展中国家迫切需免疫效果好且廉价的疫苗,一次免疫就能达到免疫保护。基因重组技术和反向遗传技术研制的新型狂犬病疫苗、基因工程疫苗,可以通过细胞系统扩大培养,但其免疫原性较弱;DNA疫苗较容易扩大培养,但是这些疫苗与亚单位疫苗的抗原表达量较低,没有得到理想应用;其它新型疫苗,包括基因重组疫苗(痘病毒载体疫苗和腺病毒载体疫苗)现在仍然在审查中。因此研制免疫效力高,廉价的狂犬病疫苗,是狂犬病疫苗急待解决的问题。 本次试验使用的以HIV-1型为基础的慢病毒载体,能够携带外援基因容量大,可以感染分裂细胞和非分裂细胞,可以整合到靶基因组上,能够在靶细胞中稳定和长期表达,并且删除病毒复制的必须基因,安全性较好,免疫排斥小,不会引起免疫排斥反应。 本试验参考GeneBank中狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因序列,合成一对特异性引物,通过RT-PCR反应,获得狂犬病病毒糖蛋白基因,狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因连接至T载体,经测序正确后,使用限制性内切酶EcoR V和BamHⅠ双酶切,并回收狂犬病糖蛋白基因;首先将慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen用EcoKⅠ酶切作用1h后,加入0.5μl Klenow和1μl dNTP Mixture作用30min,将5′端补平,通过凝胶回收试剂盒回收片段,再将回收片段用BamHⅠ单酶切,再次回收载体片段作为连接用载体;然后将糖蛋白基因与制备的载体按9:1的比例用T4连接酶16℃连接12h,构建表达载体pLVX-IRES-ZsGreen -SRV9G;将构建的含有糖蛋白基因的重组表达载体与包膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2共转染293T包装细胞,通过荧光显微镜观察报告基因(ZsGreen)表达情况,收集上清,经浓缩后接种293T细胞,得到重组慢病毒感染细胞,经RT-PCR反应检测外援基因能够在感染细胞内转录。 重组病毒肌肉注射免疫小鼠的免疫试验,经Western blot检测表明,重组病毒可以刺激机体,产生抗狂犬病糖蛋白的特异性抗体。经过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)表明,经过免疫2周后,可以检测到抗狂犬病中和抗体,第3周后,产生的抗狂犬病中和抗体的达到最高,且高于0.5IU/ml (疫苗最低保护单位)。 本试验获得表达狂犬病病毒糖蛋白的重组病毒pLVX-IRES-ZsGreen-SRV9G,对获得的重组病毒进行生物学和免疫学验证。该重组病毒可以通过肌肉注射免疫小鼠,能够刺激机体产生抗狂犬病中和抗体。本研究对研制狂犬病病毒重组疫苗奠定了基础。


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1 邱沙洛;黄福林;;狂犬病病毒的电镜观察及该病的传播[J];自然杂志;1988年09期
2 李萍;对狂犬病病毒核酸疫苗的免疫应答[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;1996年02期
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9 梁秀梅,于潜;狂犬病病毒和狂犬病[J];生物学通报;1994年06期
10 李萍;携带狂犬病病毒糖蛋白基因的质粒载体能诱导保护性免疫力[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;1995年02期
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12 范氾;;诡异的狂犬病毒[J];自然与科技;2010年02期
13 张守峰,扈荣良,肖跃强,田向阳,夏咸柱;表达狂犬病病毒糖蛋白的重组犬2型腺病毒的构建[J];中国病毒学;2005年02期
14 钱爱东,侯世宽,张茂林,李红卫,涂长春,殷震;狂犬病病毒糖蛋白基因主要功能区的克隆和序列比较分析[J];中国兽医学报;1996年06期
15 钱爱东,侯世宽,何昭阳,刘清河,殷震;RV野毒株的鉴定、毒力实验及其核酸探针的研究[J];吉林农业大学学报;1997年01期
16 苏华,张鹏飞;狂犬病病毒糖蛋白和核蛋白基因的克隆及其重组蛋白在昆虫细胞中的表达[J];中华微生物学和免疫学杂志;1998年05期
17 吴小红;酵母细胞产生的狂犬病病毒糖蛋白类似物的结构与抗原性研究[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;1999年05期
18 袁慧君,扈荣良,张守峰,包世俊,涂长春;狂犬病病毒糖/核蛋白基因疫苗和IL-18在犬的免疫试验研究[J];中国人兽共患病杂志;2004年12期
19 齐瑛琳;杨松涛;金宏丽;赵丽丽;冯娜;夏咸柱;;反向遗传学技术在狂犬病病毒研究中的应用[J];中国病原生物学杂志;2010年11期
20 高佃平;张曼夫;;表达狂犬病病毒糖蛋白的复制缺陷型重组腺病毒的构建[J];中国兽医学报;2007年01期
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1 房丽君;狂犬病病毒糖蛋白基因重组慢病毒载体的构建及免疫试验[D];吉林大学;2011年
2 于金宁;中国狂犬病毒时空动力学及其与狂犬病疫情的关系[D];山东大学;2010年
3 吴慧;中国狂犬病流行现状及病毒P、M基因遗传进化研究[D];山东大学;2010年
4 李浩;中国狂犬病2007年流行特征及病毒N基因分子流行病学研究[D];中国疾病预防控制中心;2010年
5 丁继超;云南省狂犬病流行特征及病毒分子流行病学研究[D];大理学院;2010年
6 尹翠萍;2007-2011年中国狂犬病流行状况及病毒N基因特征分析[D];山东大学;2012年
7 杨健;2010年-2011年广西地区动物狂犬病分子流行病学调查[D];广西大学;2012年
8 张娟;中国狂犬病动力学建模及防控措施研究[D];中北大学;2012年
9 安立群;天津市居民狂犬病知晓及狂犬病预防处置门诊调查[D];天津医科大学;2011年
10 赵云蛟;狂犬病病毒野毒株糖蛋白基因测序及分析比较[D];吉林农业大学;2002年
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1 本报记者 任倩茹;我州采取措施确保2011年狂犬病例“零报告”[N];凉山日报(汉);2011年
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5 郝仁;大家都来重视狂犬病[N];中国畜牧兽医报;2006年
6 谢苗枫 龙瀚 陈枫 粤卫信;专家会诊:狂犬病害死六龄童[N];南方日报;2011年
7 郑灵巧;近十年狂犬病发病大幅上升[N];健康报;2007年
8 丁厚勤;全力做好狂犬病防控工作[N];菏泽日报;2006年
9 谷峰;油菜花儿开谨防狂犬病[N];中国中医药报;2007年
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