茯苓诱变育种、液体发酵与多糖生物活性的研究

【摘要】：茯苓是珍贵的药食两用真菌,茯苓多糖具有增强免疫力、抗肿瘤等诸多功效,是茯苓中一类具有广泛生理活性的物质。随着科学技术的高速发展,多糖的诸多生物学功能引起了人们的关注。 为了探讨紫外线诱变育种在茯苓优良菌种选育中的应用,将茯苓孢子悬液经紫外线照射后,通过茯苓优良菌种筛选模型筛选得到茯苓优良菌株P6。菌株P6摇瓶液体发酵后每升发酵液中菌丝体干重达11.92g/L,较出发菌株P0菌丝体干重提高了7.58%。菌株P6传代培养后,用摇瓶液体发酵验证其遗传稳定性,实验结果表明其遗传稳定性良好。 采用PDA培养基进行转管培养,对6株不同来源的茯苓菌株进行活化、复壮;测定发酵液pH值、还原糖含量和菌体量,绘制茯苓液体发酵生长曲线；观察记录不同固体斜面培养基菌龄对发酵适应期和对数生长期时间的影响；在单因素分析(温度、转速、接种量、装液量、碳源种类和氮源种类)的基础上进行L934正交分析,优化茯苓液体发酵的发酵培养基和培养条件；正交试验结果表明,茯苓发酵的最适培养条件为：温度26℃、转速140r/min、接种量10%、装液量100mL/250mL；碳源葡萄糖,浓度2.5%,氮源牛肉浸膏,浓度2%,KH2P04/MgS04为0.6%/0.3%,维生素B14mg/100mL。绘制出茯苓液体发酵生长曲线,并确定25日龄为最适固体斜面培养基菌龄。 对发酵液中提取的茯苓多糖进行羧甲基化的结构改造,获得了较高生物活性的羧甲基茯苓多糖,并通过多步纯化、组分分析、理化结构性质的鉴定,结果表明：茯苓多糖为纯品,未检测出核酸、蛋白质等杂质,仅由羧甲基葡萄糖组成,茯苓多糖是β-D构型的葡聚糖,糖环为毗喃型,糖苷键的连接方式为β—(1→3),分子量大约为4.2×104Da,旋光度为-3.1°,特性黏数为62.55。相对于原茯苓多糖,茯苓多糖的结构、性质发生了一些变化,多糖的羧甲基化改造取得了一定的效果。 尽管有文献报道茯苓的煎剂有抗菌的效果,但是我们的初步实验并没有观测到茯苓多糖明显的抗菌效应。 通过MTT法筛选,发现茯苓多糖对HepG2有抑制作用,对乳腺癌细胞无抑制作用,IC50为146.1 ug/ml。茯苓多糖对HepG2的抑制在加药后的6个小时作用效果明显。我们更是通过先进的流式细胞技术进一步的证实了茯苓多糖对HepG2的诱导凋亡作用。通过粘度法初步测定了茯苓多糖组分的平均分子量在1×104左右。通过透析膜将茯苓多糖的组分进一步细分发现P3K和P8K对HepG2都有抑制作用,两者可能存在叠加效应。